凝膠電泳儀是以瓊脂糖凝膠作為載體的電泳，廣泛用于核酸的研究，為DNA分子及其片段的分子量測(cè)定和DNA分子構(gòu)象分析提供了重要手段。

凝膠電泳儀的原理

　　凝膠電泳儀是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳儀。其分析原理與其他支持物電泳的Z主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

　　瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。

　　DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

影響凝膠電泳移動(dòng)的因素

　　瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定。

　　1、DNA的分子大小

　　線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。?

　　2、瓊脂糖濃度

　　一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

　　3、DNA分子的構(gòu)象

　　DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)Z快，而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)Z慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

　　4、電源電壓

　　在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。?

　　5、嵌入染料的存在

　　熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15%。

　　6、離子強(qiáng)度影響

　　電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率Z小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

凝膠的性能指標(biāo)

　　瓊脂糖凝膠電泳儀是以瓊脂糖凝膠作為載體的電泳，廣泛用于核酸的研究。瓊脂糖凝膠的性能指標(biāo)有電滲、膠凝溫度、熔化溫度、凝膠強(qiáng)度和脫水收縮作用等。

　　1、電滲：

　　電滲是瓊脂糖凝膠電泳中由多糖骨架上的帶電基團(tuán)引起的，主要是由硫酸酯和丙酮酸鹽引起，這些陰離子基團(tuán)被固定在載體中，相應(yīng)的陽離子與其結(jié)合水一起向負(fù)極移動(dòng)。

　　2、膠凝溫度：

　　將瓊脂糖凝膠在溶液中加熱至90℃溶解后降溫，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)時(shí)的溫度即為凝固點(diǎn)，稱為膠凝溫度。一般在35～43℃。

　　3、熔化溫度：

　　將凝固的瓊脂糖凝膠由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)的溫度即為熔化點(diǎn)，稱為熔化溫度。一般在75～90℃。

　　4、凝膠強(qiáng)度：

　　凝膠強(qiáng)度是指每平方厘米的瓊脂糖凝膠所能承受的重量。凝膠強(qiáng)度與凝膠濃度成正比。

　　5、脫水收縮作用：

　　脫水收縮作用是指由于瓊脂糖凝膠骨架收縮使一部分液體從凝膠中分離出來的現(xiàn)象。

凝膠的制備

　　瓊脂糖凝膠是從瓊脂中精制出來的白色膠狀多糖，是由1,3連接的β-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水β-D吡喃半乳糖交替而成的中性物質(zhì)。瓊脂糖由于氫鍵和其它力的作用使其相互盤繞成繩狀瓊脂糖束，而形成大網(wǎng)孔型凝膠。

　　瓊脂是從海藻中提取出來的多糖體，主要由瓊脂糖(約占80%)和瓊脂膠組成。

　　瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，從瓊脂膠中脫去硫酸酯基和丙酮酸酯基可獲得瓊脂糖。瓊脂膠和瓊脂糖的結(jié)構(gòu)相似，但由于瓊脂膠含硫酸根和羧基，凝膠能力差;瓊脂糖中存在極微量的硫酸根和丙酮酸酯基取代電離基團(tuán)，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲;硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用，從而影響電泳速度和分離效果。

　　在瓊脂糖凝膠制備過程中需要把瓊脂膠盡量除去。質(zhì)量較好的瓊脂糖凝膠的硫酸根含量較低，通常小于0.2%，電滲較小。