Real-Time PCR 技術(shù)，又稱實時定量熒光PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，Z后通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。下面就讓小編帶你了解一下熒光定量PCR技術(shù)。

和普通PCR的差異

熒光定量PCR技術(shù)，然而，實際上，PCR擴增曲線是S形曲線，而不是不是標準的指數(shù)曲線。

這是由于擴增規(guī)模隨著PCR循環(huán)的增多而迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不能達到要求，從而導致PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度也越來越低。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種復雜環(huán)境因素的相互作用，難以精確控制不同的PCR反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低。因此，即使是多次PCR重復實驗，，擁有基本一致的各種條件，也會得到大不相同的各種結(jié)果。因此，起始DNA拷貝數(shù)不能夠按照Z終PCR產(chǎn)物的量直接計算出來。

熒光定量PCR的方法

熒光定量PCR使用熒光探針和熒光染料兩種熒光化學，熒光定量 PCR 的方法也有特異類和非特異類兩類。在PCR反應中，產(chǎn)物通過利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測，稱為特異性檢測方法。在PCR反應體系中，將過量熒光染料加入，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。叫做非特異性檢測方法。第二種方法更容易實行，然而diyi種方法增加了探針的識別步驟，具有更高的特異性。

特異性Taqman水解探針法

Taqman熒光探針是Taqman熒光定量技術(shù)的基礎，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，淬滅基團吸收發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號。

當PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性酶切降解了探針，分離了熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團，從而使得熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，也就是說，每當有一條DNA鏈被擴增，就會形成一個熒光分子，使熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的完全同步得以實現(xiàn)，從而實現(xiàn)定量，F(xiàn)AM, TET, VIC, HEX為常用的熒光基團。

非特異性SYBR Green I染料法

SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出的熒光微弱，然而一旦和雙鏈DNA結(jié)合后，大大增強了熒光效果。所以，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量有密切的關系，PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量可以根據(jù)熒光信號檢測出來。