在反應(yīng)中對能量轉(zhuǎn)移有所參與并且Z后通過發(fā)射光子的形式將能量釋放的化合物，叫做發(fā)光劑。按照上述發(fā)光特點(diǎn)，發(fā)光劑包含化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑以及熒光素三種。電化學(xué)發(fā)光劑、直接化學(xué)發(fā)光劑與酶促反應(yīng)的發(fā)光底物的發(fā)光劑發(fā)光劑為常用的三種化學(xué)發(fā)光劑。

電化學(xué)發(fā)光劑

在電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)發(fā)出光的物質(zhì)，稱為電化學(xué)發(fā)光劑。氧化反應(yīng)通過陽性電極表面電子供體三丙胺（TPA）與化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+同時有一個電子失去而發(fā)生。[Ru(bpy)3]2+從二價而被氧化成三價，變成強(qiáng)氧化劑，陽離子自由基TPA+由于TPA失去電子后被氧化而產(chǎn)生，然而它非常不穩(wěn)定，自由基TPA會因?yàn)殛栯x子自由基TPA將一個質(zhì)子（H+）自發(fā)地失去而形成，變?yōu)橐粋€強(qiáng)還原劑，三價的[Ru(bpy)3]3+通過吸收一個高能量的電子使得激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+形成。

激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，一個波長為620nm的光子很快被發(fā)射出，回到了基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。在電極表面能夠周而復(fù)始地進(jìn)行這一過程，使得大量的光子產(chǎn)生，增強(qiáng)了光信號。

直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑不需要酶來催化，僅要對溶液的pH等條件進(jìn)行改變就可以發(fā)光的物質(zhì)。例如在有過氧化氫的稀堿溶液中吖啶酯（acridinium, AE）能夠發(fā)光。

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

通過酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，叫做酶促反應(yīng)的發(fā)光底物。目前，堿性磷酸酶（AP）與辣根過氧化物酶（HRP）為化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶。4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）和3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）為AP的發(fā)光底物。對-羥基苯 乙 酸和魯米諾為HRP的發(fā)光底物。

1. 4-MUP

4-甲基傘形酮由ALP催化4-MUP而生成，在360nm的激發(fā)光的作用下，有448nm的熒光發(fā)出，測量可以使用熒光光度計(jì)。

2. AMPPD

在堿性條件下，AMP-D陰離子由ALP酶解AMPPD而產(chǎn)生，其狀態(tài)很穩(wěn)定，其有2-30min的分解半衰期，有波長為470nm的持續(xù)性光發(fā)出，在15min時其強(qiáng)度Zgao，在15-60min內(nèi)，有相對穩(wěn)定的光強(qiáng)度。

3. 對-羥基苯 乙 酸（HPA)

若存在H2O2，對-羥基苯 乙 酸（HPA)會氧化二聚體（熒光物質(zhì)）或者被HRP氧化，在350nm激發(fā)光作用下，會有450nm波長的熒光發(fā)出，測量可以使用熒光光度計(jì)。

4. 魯米諾或其衍生物

一般在堿性緩沖液中進(jìn)行魯米諾的氧化反應(yīng)，將pH8.6Tris緩沖液作為底物液。值得一提的是，即使沒有HRP催化，魯米諾和H2O2也可以緩慢自發(fā)發(fā)光，但是會在Z后光強(qiáng)度測定中導(dǎo)致空白干擾，所以應(yīng)當(dāng)分別成2瓶試劑溶液，當(dāng)需要使用的時候，再立刻進(jìn)行混合。然后HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)和延長發(fā)光時間會由于HRP發(fā)光增強(qiáng)劑如某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶而增強(qiáng)，使得發(fā)光敏感度得到提高。