本文由 北京恒泰豐科試驗設(shè)備有限公司 整理匯編

2013-11-30 00:00 337閱讀次數(shù)

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  　　　　　　　　細胞活性測定方法細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克?。洌┬纬煞ā?H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等?，F(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：1.MTT法MTT：化學(xué)名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。2.XTT法XTT：化學(xué)名：2,3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK-8法或稱WST-8法CCK-8試劑中含有WST8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性??；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。三種方法的比較MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需預(yù)制使用有機溶劑DMSO或其它溶劑方便性++++++檢測速度++++++重復(fù)性+++++穩(wěn)定性+++++工作量------對細胞毒性------對人體毒性-----MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項MTT原理MTT全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟?！　∪秉c：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器**用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT吸光度**在0-0.7范圍內(nèi)。MTT一般**現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，**小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件**帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl8g＋KCl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4，定容1L。普通MTT法實驗步驟：1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2：培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。藥物MTT法實驗步驟貼壁細胞：1：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調(diào)密度1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2：5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔。建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3：5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6：每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7：同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。懸浮細胞：1：收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋（儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找**稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml1640）2：置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3：每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。注意事項：（1）選擇適當(dāng)?shù)眉毎臃N濃度。（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（3）設(shè)空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，Z后比色以空白調(diào)零。（4）MTT實驗吸光度Z后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系。（5）用96孔板培養(yǎng)細胞做MTT測細胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲顆粒進行比色測定。（6）一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲洗掉，然后每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  本方法用手測定石油產(chǎn)品經(jīng)蒸發(fā)和熱解后留下的殘?zhí)苛浚蕴峁┦彤a(chǎn)品相對生焦傾向的指標(biāo)。本方法一般用于在常壓蒸餾時易部分分解、相對地不易揮發(fā)的石油產(chǎn)品。對含有能生灰組分的石油產(chǎn)品（用GB508《石油產(chǎn)品灰分測定法》測定）則會得到殘?zhí)恐灯叩慕Y(jié)果，誤差的大小取決于所生成灰分的量。注:①本方法中所用的“殘?zhí)俊币辉~，是指石油產(chǎn)品經(jīng)蒸發(fā)和熱解后所形成的碳質(zhì)殘余物。它不全部是碳。而是一種會進一步熱解變化的焦炭。本方法采用“殘?zhí)俊边@個詞，只是順從習(xí)慣的稱法。②本法廣泛應(yīng)用于多種石油產(chǎn)品。本方法和ZBE30001《石油產(chǎn)品殘?zhí)總?cè)定法一（蘭氏法）》這兩種方法所測得的殘?zhí)恐?，不但在?shù)俏上不相同，而且它們之間也找不到滿意的相互關(guān)系。對于一些不容易裝人蘭氏焦化球的重質(zhì)殘渣燃料油、焦化原料等油料.宜用本方法測定殘?zhí)俊Ｈ紵魅剂系臍執(zhí)恐?，可用來粗略地估計燃料在蒸發(fā)式的釜型和套管型燃燒器中形成沉積物的傾向。同樣，不含硝酸戊酯（或如果含有硝酸戊酯，則只要事先測定未加此添加劑基礎(chǔ)燃料）的柴油，殘?zhí)恐荡篌w上與燃燒室的沉積物有對應(yīng)關(guān)系。測定粗柴油的殘?zhí)恐?，對指?dǎo)粗柴油造氣的生產(chǎn)是有用的，而原油殘渣、汽缸油料和重質(zhì)潤滑油料的殘?zhí)恐?，對指?dǎo)潤滑油生產(chǎn)也是有用的。下述情況應(yīng)予注意:a.發(fā)動機油：發(fā)動機油的殘?zhí)恐担欢缺徽J為能表示發(fā)動機油在發(fā)動機的燃燒室中生成碳質(zhì)沉積物量的指標(biāo)，但由于許多石油產(chǎn)品中都存在添加劑，所以現(xiàn)在看來這一點是值得懷疑的。例如，有灰分生成的清凈添加劑，會增加石油產(chǎn)品的殘?zhí)恐担ǔ？梢詼p少石油產(chǎn)品生成沉積物的傾向。b.柴油:含有硝酸戊酯的柴油的殘?zhí)恐灯?。但是，如果對不含硝酸戊酯的柴油，或?qū)蕚湟{(diào)人硝酸戊脂的基礎(chǔ)燃料進行試驗，則其殘?zhí)恐蹬c燃燒室沉積物有近似的關(guān)系。c.含有有灰分生成的添加劑的石油產(chǎn)品:殘?zhí)恐悼赡芘c形成沉積物的傾向無關(guān)，而日可能比形成沉積物的相應(yīng)傾向要高些。本方法參照采用國際標(biāo)準ISO6615-1983《右油產(chǎn)品殘?zhí)繙y定法（康氏法）》。方法概要把已稱重的試樣置于坩堝內(nèi)進行分解蒸餾。殘余物經(jīng)強烈加熱一定時間即進行裂化和焦化反應(yīng)。在規(guī)定的加熱時間結(jié)束后，將盛有碳質(zhì)殘余物的坩堝置于干燥器內(nèi)冷卻并稱重，計算殘?zhí)恐担ㄒ栽嚇拥馁|(zhì)量百分數(shù)表示）。相關(guān)檢測儀器：YT-268康氏殘?zhí)繙y定儀康氏殘?zhí)繙y定儀[詳細]

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