參與評(píng)論

評(píng)論

登錄后參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

• 

  yolin526 2017-04-27 00:00:00

  RT-PCR檢測方法的具體步驟如下： （一）RNA提取 1、根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配制區(qū)操作）。 2、在生物安全柜內(nèi)將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。 4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。 5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。 6、于濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。 7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。 8、棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。 9、將濾柱移到一個(gè)干凈的1.5mL eppendorf管上，向?yàn)V柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。 10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20℃以下保存。 注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。 （二）反應(yīng)體系配制 1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 檢測標(biāo)本RNA 陰性對(duì)照：無菌水（標(biāo)本RNA提取時(shí)，跟標(biāo)本同時(shí)提取無菌水。） 陽性對(duì)照：已知病毒RNA 2、PCR反應(yīng)體系配制（在體系配制區(qū)配反應(yīng)液） 1）按下表加入試劑： PCR反應(yīng)體系 對(duì)每一個(gè)建立的反應(yīng)確定反應(yīng)數(shù)（n=擬進(jìn)行的PCR管數(shù)，包括陰性，陽性對(duì)）。考慮到陰性無模板對(duì)照，陽性對(duì)照，誤差，制備過量的反應(yīng)混合物是必要的。具體如下： （1）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）為1到14，那么N=n+1； （2）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）大于15，那么N=n+2。 2）將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標(biāo)記。 3）加RNA模板（在核酸提取區(qū)） 將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對(duì)照管（5μL無菌水），然后分別加標(biāo)本RNA（每管5μL），Z后加入陽性對(duì)照RNA（每管5μL）。 3、RT-PCR反應(yīng) 將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR儀進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。 4、RT-PCR產(chǎn)物檢測 1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內(nèi)，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻后加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產(chǎn)生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時(shí)，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之后，將梳子拔出。 2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。 3）PCR產(chǎn)物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻后加入電泳膠孔內(nèi)（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加標(biāo)本PCR產(chǎn)物，再加陰性對(duì)照，Z后加陽性對(duì)照產(chǎn)物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min后看結(jié)果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。 5、結(jié)果判斷。RT-PCR檢測方法的具體步驟如下： （一）RNA提取 1、根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配制區(qū)操作）。 2、在生物安全柜內(nèi)將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。 4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。 5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。 6、于濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。 7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。 8、棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。 9、將濾柱移到一個(gè)干凈的1.5mL eppendorf管上，向?yàn)V柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。 10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20℃以下保存。 注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。 （二）反應(yīng)體系配制 1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 檢測標(biāo)本RNA 陰性對(duì)照：無菌水（標(biāo)本RNA提取時(shí)，跟標(biāo)本同時(shí)提取無菌水。） 陽性對(duì)照：已知病毒RNA 2、PCR反應(yīng)體系配制（在體系配制區(qū)配反應(yīng)液） 1）按下表加入試劑： PCR反應(yīng)體系 對(duì)每一個(gè)建立的反應(yīng)確定反應(yīng)數(shù)（n=擬進(jìn)行的PCR管數(shù)，包括陰性，陽性對(duì)）?？紤]到陰性無模板對(duì)照，陽性對(duì)照，誤差，制備過量的反應(yīng)混合物是必要的。具體如下： （1）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）為1到14，那么N=n+1； （2）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）大于15，那么N=n+2。 2）將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標(biāo)記。 3）加RNA模板（在核酸提取區(qū)） 將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對(duì)照管（5μL無菌水），然后分別加標(biāo)本RNA（每管5μL），Z后加入陽性對(duì)照RNA（每管5μL）。 3、RT-PCR反應(yīng) 將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR儀進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。 4、RT-PCR產(chǎn)物檢測 1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內(nèi)，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻后加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產(chǎn)生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時(shí)，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之后，將梳子拔出。 2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。 3）PCR產(chǎn)物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻后加入電泳膠孔內(nèi)（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加標(biāo)本PCR產(chǎn)物，再加陰性對(duì)照，Z后加陽性對(duì)照產(chǎn)物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min后看結(jié)果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。 5、結(jié)果判斷。

  贊(14)

  回復(fù)(0)

  評(píng)論

  評(píng)論

  登錄后參與評(píng)論