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- af05522 2017-01-22 00:00:00
- rtpcr時(shí)提取rna的濃度和純度要求：濃度20ng/ul以上足夠了，如果用的是組織提取，濃度一般很高，可以達(dá)到幾百甚至幾千。如果你用的是病毒、少量細(xì)胞，濃度低一些也沒(méi)有關(guān)系。 純度需要用儀器測(cè)一下。260/280理論值應(yīng)該有2.0以上，260/230值1.2以上基本合格。 RT-PCR：Z重要的是RNA是否有明顯降解，這個(gè)需要跑電泳看。一般來(lái)說(shuō)28S應(yīng)該比18S亮1.5-2.0倍，說(shuō)明提取得不錯(cuò)。 反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組 DNA的污染。 提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。
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- 有一篇文獻(xiàn)中使用高氯酸同時(shí)提取DNA和RNA，具體步驟如下：取2mL0.5% 組織勻漿液，加入 1mL0.6mol/L冷高氯酸，冰上放置10min后500g離心10min， 棄上清，沉淀物用2mL0.2mol/L高氯酸洗滌兩次，兩次洗滌后都以500g離心l0min，棄上清，將沉淀物溶解于2mL0.3mol/L... 有一篇文獻(xiàn)中使用高氯酸同時(shí)提取DNA和RNA，具體步驟如下：取2mL0.5% 組織勻漿液，加入 1mL0.6mol/L冷高氯酸，冰上放置10min后500g離心10min， 棄上清，沉淀物用2mL0.2mol/L高氯酸洗滌兩次，兩次洗滌后都以500g離心l0min，棄上清，將沉淀物溶解于2mL0.3mol/L的KOH，37℃條件下培養(yǎng)60min，然后加入1mL1.2mol/L高氯酸，冰上放置10min，500g離心15min，收集上清液(I)，沉淀物用2mL0.2mol/L高氯酸溶解后再離心，再收集上清液(II)，集中上清液(I和II)用于RNA濃度的測(cè)定，沉淀物用于測(cè)定DNA的濃度。 不知各位有沒(méi)有用過(guò)這種方法，高氯酸的作用是什么？請(qǐng)賜教！ 展開(kāi)
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