液相色譜儀出峰不佳，峰分叉的原因

做液相色譜的同學(xué)基本都會(huì)碰到分叉峰，

很多時(shí)候，

這都意味著硬件或者方法某些地方可能出現(xiàn)問(wèn)題。

今天我們就一起看看導(dǎo)致峰分叉的原因，

以及如何解決這個(gè)問(wèn)題。

首先，我們需要判斷，

這到底是一個(gè)峰，還是兩個(gè)峰?

a圖主峰前面有一個(gè)肩峰，

這到底是峰形不好，

還是另外一個(gè)化合物沒(méi)分開(kāi)呢?

判斷方法

降低該成分在樣品中的濃度

b圖是降低該成分濃度后，

進(jìn)樣后得到的色譜圖。

如果這是一個(gè)峰，

那肩峰也應(yīng)該響應(yīng)變小，

但是這個(gè)例子里，

肩峰沒(méi)有變小，

這應(yīng)該是另外一個(gè)化合物。

這時(shí)候，我們就要考慮如何改變方法

將這兩個(gè)東西分開(kāi)。

如果所有峰的峰形都不好

一般來(lái)說(shuō)，

一個(gè)樣品都會(huì)出多個(gè)峰。

峰形不好，絕大多數(shù)時(shí)候

在每個(gè)峰上面都會(huì)出現(xiàn)。

比如像下面這樣：

a圖是所有峰都拖尾，

b圖是所有峰都有肩峰，

也可以說(shuō)峰分叉，

這種情況一般都是色譜柱頭塌陷

或者柱頭的篩板被堵導(dǎo)致的。

為什么會(huì)導(dǎo)致峰形問(wèn)題呢？

請(qǐng)看下面的圖

a圖是正常的柱頭，

b圖是篩板被堵的柱頭。

正常情況下，

所有樣品分子都是均勻通過(guò)色譜柱，

形成一個(gè)對(duì)稱的峰形。

堵塞的情況下，

有一部分樣品分子進(jìn)入色譜柱就會(huì)受到阻擾，

導(dǎo)致時(shí)間拖后，形成拖尾。

對(duì)于色譜柱塌陷的情況，

用同樣的方法大家也不難理解。

只不過(guò)這時(shí)候，

是一些樣品分子可能跑的比正常的快了一些。

如何解決這個(gè)問(wèn)題呢？

1  反沖

柱出口放空，

沖20-30ml流動(dòng)相。

雖然柱子上都有表明使用方向，

但是對(duì)于硅膠基質(zhì)的色譜柱

基本都可以反沖。

將柱頭污染物

如泵密封圈的碎屑，

樣品中的污染等沖走，

就能解決問(wèn)題。

當(dāng)然，還是要提倡大家注意

樣品上機(jī)之前的前處理

和及時(shí)更換磨損的泵密封圈。

有條件的還是用保護(hù)柱，

大不了就換保護(hù)柱，

也比換色譜柱強(qiáng)。

2  更換或清洗篩板

現(xiàn)在估計(jì)做這個(gè)事情的人不多，

但是誰(shuí)有廢柱子，

想練練也未嘗不可。

我們一起看看一個(gè)實(shí)際的例子

根據(jù)之前說(shuō)的，

可能是柱頭堵了，

或者塌陷了。

但是進(jìn)一步檢查，

發(fā)現(xiàn)另有原因。

方法用的150 mm 4.6 mm, 5 um C18 柱子，

78% 乙腈，1.5ml/min，等度方法，

進(jìn)樣10ul，100%乙腈溶解的樣品。

一般來(lái)說(shuō)，

雖然10ul的純乙腈不會(huì)引起峰形不好，

但是有時(shí)候樣品溶劑的極性跟流動(dòng)相差異較大時(shí)，

的確會(huì)引起峰形的問(wèn)題。

我們?cè)趺崔k呢？

01

從最容易的辦法做起，

降低溶劑乙腈的比例，

降到50%看看。

從下圖b，4min的峰可以看出，

沒(méi)啥改觀。

02

接下來(lái)反沖柱子，

結(jié)果如圖c，

基本沒(méi)變化。

算了，明天再說(shuō)吧。

03

第二天來(lái)到實(shí)驗(yàn)室，

還能干嘛呢? 

更換篩板?

算了，直接換柱子吧！

結(jié)果如d，

噢，好很多噢。

之前柱子肯定有問(wèn)題，扔了。

但是峰還是有點(diǎn)寬，

估計(jì)還是哪兒有問(wèn)題。

手上忙，沒(méi)時(shí)間管這個(gè)。

04

幾天過(guò)后，

重新配了流動(dòng)相，

一跑，好了，如圖e。

雖然到底什么原因?qū)е轮胺逍蔚膯?wèn)題，

已經(jīng)無(wú)從查找

（柱子扔了，舊流動(dòng)相也沒(méi)了），

但是也給我們提供了一個(gè)解決問(wèn)題的步驟：

1

確定峰形問(wèn)題

是所有峰都有問(wèn)題，

還是就是某一個(gè)峰有問(wèn)題。

如果所有峰都有問(wèn)題，

基本都是色譜柱，

或者儀器管路連接的問(wèn)題。

如果是某一個(gè)峰有問(wèn)題，

那就要從方法上來(lái)考慮，

是否需要改變流動(dòng)相比例，

pH值，色譜柱溫度等等。

2

從最簡(jiǎn)單的做起

從不需要換什么東西的方法做起。

比如改變樣品溶劑，

反沖色譜柱等等。

3

換東西

換保護(hù)柱，換色譜柱，

換流動(dòng)相(新配)，

一步一步的換，

有助于找到問(wèn)題的根本。

4

總結(jié)經(jīng)驗(yàn)

問(wèn)題解決后，

想想需不需要采取什么措施，

防止類似問(wèn)題的發(fā)生，

比如說(shuō)常換流動(dòng)相啦，

及時(shí)更換密封圈啦，

記錄進(jìn)樣次數(shù)

了解什么時(shí)候色譜柱就不行了啊之類的。

希望以上信息能夠讓各位同學(xué)

在碰到峰形不好的問(wèn)題時(shí)，

有一些思路，

不至于手足無(wú)措。

也歡迎大家留言補(bǔ)充

上面沒(méi)有提到的可能影響峰形的可能。

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熒光檢測(cè)器無(wú)峰是什么原因?

1.3.色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學(xué)作用。

如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖3），則問(wèn)題Z早應(yīng)出現(xiàn)在分析物通過(guò)色譜柱遷移之前（主要問(wèn)題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前）。

這種峰形變形Z常見(jiàn)的致因是：玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞（此類峰變形Z常見(jiàn)的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷）。

除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會(huì)受到空隙的影響（輕易不會(huì)發(fā)生塌陷）。

但是，玻璃料（篩板）堵塞仍然是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題。對(duì)于5m顆粒柱（的色譜柱），入口端的玻璃料（篩板）通常具有2.0m的孔隙度；對(duì)于（顆粒）3m的色譜柱，具有0.5m的孔隙度。
如果顆粒物來(lái)自于樣品，或顆粒物是因泵密封磨損或流動(dòng)相到達(dá)色譜柱而產(chǎn)生的（磨損的泵密封圈或者流動(dòng)相顆粒物進(jìn)入色譜），它們通常會(huì)集中在玻璃料上（都聚集在篩板上）。

這些顆粒會(huì)影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過(guò)不同的流動(dòng)路徑到達(dá)色譜柱，因此會(huì)晚于另一部分樣品。
由于此時(shí)（此位置）未發(fā)生分離，因此所有分析物會(huì)以相同的方式變形（被擾亂），進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。

為了防止（避免）這一問(wèn)題，如果流動(dòng)相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾；并在泵密封嚴(yán)重磨損（導(dǎo)致顆粒物的產(chǎn)生）之前更換新的泵密封（密封圈）。

如果樣品含有顆粒碎片（屑），應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾（例如0.5m孔隙度過(guò)濾器（微孔濾膜））或?qū)ζ溥M(jìn)行短暫離心（例如5分鐘，>1500×g），以去除顆粒。

我們強(qiáng)烈建議在自動(dòng)進(jìn)樣器下游（之后）安裝0.5m孔隙度的串聯(lián)（在線）過(guò)濾器，以過(guò)濾任何意外進(jìn)入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)（在線）過(guò)濾器玻璃料（濾片）發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會(huì)升高；而更換玻璃料（濾片）十分簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)。采用串聯(lián)（在線）過(guò)濾器可顯著延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

圖3. 由于玻璃料或色譜柱空隙被部分堵塞（色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷），色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形。

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