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  linna0417 2005-11-23 00:00:00

  （一) 概述 離心機(jī)是借離心力分離液相非均一體系的設(shè)備。根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮和提純的方法稱為離心。一般說(shuō)， 離心機(jī)轉(zhuǎn)速在20 000r/min以上的稱為超速離心。離心技術(shù)，特別是超速離心技術(shù)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的手段。 1924年T.Svedberg和Rinde研制出世界上diyi臺(tái)渦輪超速離心機(jī)以來(lái)，發(fā)展非常迅速，現(xiàn)在已廣泛地應(yīng)用到科學(xué)研究和生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域?，F(xiàn)在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭Z高轉(zhuǎn)速已達(dá)100000 r/min，Z大離心力達(dá)700 000 g。 離心機(jī)作為一種手段，具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，超速離心可在低溫下操作，保護(hù)了生物大分子的活性。制備型的離心機(jī)負(fù)載量大，一次可分離提純幾克樣品，比層析、 電泳上的樣品量大得多。分析離心機(jī)不僅可測(cè)物質(zhì)的分子量，還可檢驗(yàn)物質(zhì)的純度、構(gòu)象、沉降系數(shù)等。因此離心技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要的地位，是分離、純 化細(xì)胞、病毒、蛋白、核酸和酶的Z方便Z有效的工具。 (二) 離心原理 當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì)上浮。微粒在重力場(chǎng)下移 動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的 沉降過(guò)程。 此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時(shí)還伴隨有擴(kuò)散現(xiàn)象。擴(kuò)散是無(wú)條件的的。擴(kuò)散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比，顆粒越小擴(kuò)散越嚴(yán)重。而沉降是相對(duì)的，有條件的，要受到外力 才能運(yùn)動(dòng)。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。對(duì)小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們?cè)谌芤褐谐赡z體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到 沉降過(guò)程的。因?yàn)轭w粒越小沉降越慢，而擴(kuò)散現(xiàn)象則越嚴(yán)重。所以需要利用離心機(jī)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，才能迫使這些微?？朔U(kuò)散產(chǎn)生沉降運(yùn)動(dòng)。 離心就是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開(kāi)。離心力(F)的大小取決于離心轉(zhuǎn)頭的角速度(ω，r/min)和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離(r，cm)。它們的關(guān)系是：F＝ω2R 為方便起見(jiàn)，F(xiàn)常用相對(duì)離心力也就是地心引力的倍數(shù)表示。即把F值除以重力加速度g (約等于9.8m/s2.)得到離心力是重力的多少倍，稱作多少個(gè)g。例如離心機(jī)轉(zhuǎn)頭平均半徑是6cm，當(dāng)轉(zhuǎn)速是60 000 r/min時(shí)，離心力是240 000×g，表示此時(shí)作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的24萬(wàn)倍。 因此，轉(zhuǎn)速r/min和離心力g值之間并不是成正比關(guān)系，還和半徑有關(guān)。同樣的轉(zhuǎn)速，半徑大一倍，離心力(g值)也大一倍。轉(zhuǎn)速(r/min)和離心力(g值)之間的關(guān)系可用下式換算： 式中：r為半徑(cm)，g為離心力(g值) （三)超速離心機(jī)的離心方法 用離心方法分離生物大分子和亞細(xì)胞物質(zhì)的基本原理是根據(jù)它們?cè)谝后w介質(zhì)中或者沉降速度不同而形成不同的區(qū)帶，或者它們的密度 不同而停留在液體介質(zhì)中不同的位置而把它們一一分開(kāi)。前者是沉降速度法，應(yīng)用該法時(shí)液體介質(zhì)的Z大密度要小于樣品中Z小顆粒的密度，離心時(shí)選用高轉(zhuǎn)速和短 時(shí)間；后者是沉降平衡法，應(yīng)用該法時(shí)液體介質(zhì)的Z大密度要大于樣品中Z小顆粒的密度，離心時(shí)選用較低轉(zhuǎn)速和較長(zhǎng)時(shí)間。實(shí)際操作有幾種形式： 1.差速離心 這種方法是選擇不同轉(zhuǎn)速的離心，分別分離各個(gè)不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液，在高速離心上清沉降中等顆粒，Z后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級(jí)提高離心力分離上情液的方法，把不同大小的顆粒分開(kāi)。 這種方法比較簡(jiǎn)單，方便。分離的組份沉到管底，因此可以迅速濃縮所要的組份，減少體積。但回收率和純度是有矛盾的，要提高回收率，勢(shì)必提高轉(zhuǎn)速或延長(zhǎng)離心時(shí)間，這樣大小相近的顆粒也會(huì)沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。 2.速度區(qū)帶(或速度梯度)離心 本法是將樣品放在一個(gè)連續(xù)的密度梯度液體上，通過(guò)離心，大顆粒沉降快，小顆粒沉降慢。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，相同的顆粒就在同一深度 形成一條帶子，因此把各種組份分開(kāi)來(lái)。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質(zhì)，如不同的蛋白質(zhì)組份密度都差不多，但分子量不一樣，用本法很容易將其分 開(kāi)。但對(duì)密度不同、大小類似的物質(zhì)則不易分離。 蔗糖梯度是一種常用的介質(zhì)。用不同濃度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度，用于梯度離心。再分別進(jìn)行收集處于不同區(qū)帶里的各個(gè)組份。 3.沉降平衡離心 這是靜力學(xué)的方法。在離心管中形成一個(gè)液體梯度，在離心時(shí)各組份以不同的速度下沉，但Z終停留在與自己相同的密度中，形成一條狹窄的平 衡帶，并保持相對(duì)的穩(wěn)定。為了使樣品所有組份都能達(dá)到它們的平衡位置，需要長(zhǎng)時(shí)間離心。這種方法適用于分離大小相似但密度不同的物質(zhì)，如核酸的分離。氯化 銫梯度是常用于平衡離心的介質(zhì)，分辨率很高，可區(qū)別密度相差0.05的組分，但離心時(shí)間需十幾到幾十小時(shí)，且價(jià)格很貴?，F(xiàn)在已有一種商品名叫” Percoll”的聚蔗糖溶液可以代替氯化銫梯度。該介質(zhì)能迅速形成梯度，使離心時(shí)間大大縮短到1-2h而仍有很好的分離效果。并且有配套的標(biāo)記珠 （Density marker beads）可以測(cè)定樣品的密度。

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