參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  厄爾多思2 2010-12-12 00:00:00

  這寫起來復(fù)雜了....... 很多地方都有這樣的實(shí)驗(yàn)步驟啊，我看了一下 下面這個(gè)，還可以 酶的分離簡單，就是麻煩，時(shí)間挺長的 酶的分離純化方法簡介 生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。 酶的來源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。 因此，在提取某一種酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶Z豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有很多，既不受氣候地理?xiàng)l件限制，而且動植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉價(jià)原料可以大量生產(chǎn)。 由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時(shí)，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。 酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個(gè)酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。 酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹： 一、預(yù)處理及固液分離技術(shù) 1.細(xì)胞破碎（cell disruption） 高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質(zhì)器兩次。Z好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人報(bào)道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時(shí)，破碎率可達(dá)。當(dāng)壓力超過70Mpa時(shí)，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時(shí)更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸菌更難破碎。 容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價(jià)格便宜，常用來裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。 2.離心 離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。過濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。 在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個(gè)步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。該離心機(jī)又如一個(gè)密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如BTPX205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機(jī)的其他輔助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力量計(jì)、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?3.膜分離技術(shù) 在蛋白質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機(jī)械強(qiáng)度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質(zhì)沒有破壞。 超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液。 超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時(shí)應(yīng)注意以下問題：diyi，在超濾循環(huán)過程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及控制系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時(shí)易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。 還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時(shí)，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來，洗脫液用于進(jìn)一步的分離純化。 4.泡沫分離 原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。 蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴(kuò)散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排，一般認(rèn)為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發(fā)生由多個(gè)分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。 泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/Z初溶液中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/Z初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)Z大。 二、抽提 沉淀 1. 鹽析 常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價(jià)格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng)，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來。對酶沒有破壞作用。 pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度Z小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差，因此要選擇Z佳pH值.一般要求在酶Z穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮Z適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定Z佳pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。 溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。 酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間，使酶蛋白完全沉淀下來，酶靜置后，就不要再加以攪拌。 2．有機(jī)溶劑沉淀 有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。 有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會變成失活。因此用有機(jī)溶劑處理時(shí)Z好在0℃以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。 3.聚合物絮凝劑沉淀 聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。 4．用金屬離子和絡(luò)合物沉淀 酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的]金屬離子會催化酶變性而失活。 5．用特殊試劑沉淀法 用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。 6．親和沉淀 將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機(jī)結(jié)合形成了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物，該復(fù)合物與生物分子結(jié)合后在一定條件下可以沉淀出來。 配基-載體復(fù)合物可以選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液中的pH值、離子強(qiáng)度及蛋白質(zhì)濃度等條件對親和結(jié)合的影響力并不大，只有競爭性的配基會降低產(chǎn)物與原配基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。 引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團(tuán)；改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。 親和結(jié)合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)節(jié)好有關(guān)沉淀的條件，使之有利于親和結(jié)合。 洗滌：為經(jīng)過處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分離目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當(dāng)?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋恚俪恋?；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉淀。在上述過程中要始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處于親和結(jié)合狀態(tài)。 配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離：分離結(jié)束之后，要確保回收目的蛋白質(zhì)和配基-載體復(fù)合物，目的蛋白質(zhì)要達(dá)到一定的純度，回收率要高。

  贊(12)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論