脊髓性肌萎縮癥（SMA）

脊髓性肌萎縮癥（SMA），是一類由脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致肌無力、肌萎縮的疾病。由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能基因(SMN1) 隱性突變引起，屬常染色體隱性遺傳病，臨床并不少見。主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性，肢體近端為主的廣泛性弛緩性麻痹與肌萎縮，智力發(fā)育及感覺均正常。

SMN1基因編碼存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（SMN）蛋白 ——一種遍布全身的蛋白質(zhì)，對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持和功能至關(guān)重要。大腦和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元控制整個(gè)身體的肌肉運(yùn)動(dòng)。如果沒有足夠的功能性SMN蛋白，那么運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元就會(huì)死亡，導(dǎo)致衰弱且通常致命的肌肉無力。由SMN1基因突變引起的SMA通常根據(jù)發(fā)病年齡和嚴(yán)重程度分為幾種亞型；其中嬰兒發(fā)病的SMA是Z嚴(yán)重和Z常見的亞型?；加羞@種疾病的兒童頭部抬頭，吞咽和呼吸都有問題。這些癥狀可能在出生時(shí)出現(xiàn)，也可能在6個(gè)月后出現(xiàn)。

近十年來，在針對(duì)SMA患者的ZL策略方面取得了顯著進(jìn)展：2016年12月Nusinersen反義寡核苷酸療法迅速獲得FDA批準(zhǔn)用于所有年齡的SMA患者，可提高SMN蛋白表達(dá)并改善輕度SMA兒童和青少年的運(yùn)動(dòng)功能；2019年5月批準(zhǔn)的靜脈注射表達(dá)SMN1 cDNA (scAAV9-SMN)的 重組腺相關(guān)病毒基因療法onasemnogene abeparvovec-xioi用于提高2歲及以下嬰兒的生存和運(yùn)動(dòng)機(jī)能。

因?yàn)镾MN水平無法在活著的患者的神經(jīng)系統(tǒng)中測(cè)量，有關(guān)疾病相關(guān)的SMN表達(dá)水平變化和與疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)很少。了解SMN在正常和患病人群、以及發(fā)展ZL過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化將有助于進(jìn)一步優(yōu)化臨床ZL。

來自約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員對(duì)臨床SMA患者進(jìn)行分組，對(duì)分離的人的腦、脊髓、髂腰肌、隔膜、肝等組織中SMN mRNA和蛋白水平分別進(jìn)行了量化動(dòng)態(tài)檢測(cè)。其中，采用HTRF^?（均相時(shí)間分辨熒光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行不同組織的SMN蛋白定量檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期全組織SMN蛋白水平正常下降，這支持臨床上在出生后要盡快開始SMN誘導(dǎo)ZL；部分患者由于ASOs（反義核苷酸）在脊柱和大腦吻側(cè)區(qū)域的分布有限，可能限制了這些區(qū)域的運(yùn)動(dòng)單元對(duì)這些患者的臨床反應(yīng)。這些結(jié)果對(duì)SMA患者的優(yōu)化ZL具有重要意義，并為進(jìn)一步研究提高鞘內(nèi)注射ASOs的生物利用度提供了依據(jù)。

文章技術(shù)路線：

HTRF定量脊髓標(biāo)本中SMN蛋白的表達(dá)數(shù)據(jù)(對(duì)照組為75例;n = 16例SMA，患者年齡從15周妊娠(GA)到168個(gè)月不等)，如下圖所示：

HTRF實(shí)驗(yàn)方法:

HTRF^?（均相時(shí)間分辨熒光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）技術(shù)基于時(shí)間分辨熒光（TRF）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）兩大技術(shù)原理。將熒光的靈敏性、均相免洗和低背景等特點(diǎn)結(jié)合在一起。廣泛用于GPCRs，激酶，細(xì)胞因子，磷酸化蛋白，表觀遺傳，生物大分子（抗體）等靶點(diǎn)的檢測(cè)和定量。

HTRF SMN assay kit：將10 μL細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到96/384淺孔板中，加入5μL的熒光供體（Donor）和5 μL的熒光受體(Acceptor)。孵育過夜后，直接在EnVision多模式讀板儀(PerkinElmer)或其他HTRF^?兼容的酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀值即可。

珀金埃爾默公司一如既往的為用戶提供客制化高靈敏度檢測(cè)試劑和高品質(zhì)的檢測(cè)設(shè)備：

EnVision多標(biāo)記微孔板讀板儀

識(shí)別二維碼

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Victor Nivo多標(biāo)記微孔板讀板儀

參考文獻(xiàn)

1. Ramos, Daniel M., et al. "Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment." Journal of Clinical Investigation 129.11 (2019): 4817-4831.

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文獻(xiàn)精讀第25期

文章概述

對(duì)人來說，皮膚溫度高于43℃會(huì)引起急性疼痛，長(zhǎng)時(shí)間暴露于傷害性熱刺激中會(huì)造成組織損傷，并破壞體溫的動(dòng)態(tài)平衡。脊髓背角神經(jīng)元在處理和傳遞來自背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion, DRG）痛覺傳入纖維的感覺信號(hào)中起著關(guān)鍵作用，但是，傷害性熱刺激信號(hào)在脊髓中的處理過程尚不清楚。2022年5月12日，美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員在《Neuron》雜志上發(fā)表題為“A novel spinal neuron connection for heat sensation”的文章，該研究證實(shí)了由脊髓ErbB4+（ErbB4，一種表皮生長(zhǎng)因子受體家族的酪氨酸激酶受體）神經(jīng)元能夠通過NRG1-ErbB4信號(hào)通路來調(diào)控機(jī)體對(duì)傷害性熱刺激的感受，揭示了脊髓中一個(gè)新的傷害性熱刺激感受的調(diào)控機(jī)制。

核心觀點(diǎn)

1、脊髓ErbB4+神經(jīng)元能夠被傷害性熱刺激所激活；

2、脊髓ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+傷害感受器的單突觸神經(jīng)支配；

3、消融或抑制ErbB4+神經(jīng)元會(huì)降低動(dòng)物對(duì)傷害性熱刺激的感受；

4、同時(shí)抑制脊髓中ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元能夠進(jìn)一步降低傷害性熱刺激的感受；

5、NRG1-ErbB4信號(hào)通路能夠促進(jìn)傷害性熱刺激的感受和熱痛過敏反應(yīng)。

研究結(jié)果分析

1. 傷害性熱刺激能夠激活脊髓中ErbB4+興奮性神經(jīng)元

為了識(shí)別對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)元，作者利用了EGFP表達(dá)依賴于內(nèi)源性cFos啟動(dòng)子的cFos::shEGFP小鼠。當(dāng)cFos::shEGFP小鼠受到傷害性熱刺激（52℃熱板）時(shí)，脊髓背角神經(jīng)元中的shEGFP表達(dá)增加，大量的shEGFP+神經(jīng)元位于脊髓背角表層（Ⅰ~Ⅱ?qū)樱@是傷害性感覺信息的接收區(qū)域。單細(xì)胞RT-PCR結(jié)果顯示，78%的shEGFP+神經(jīng)元為興奮性神經(jīng)元（Vglut2+），22%的shEGFP+神經(jīng)元為GABA能神經(jīng)元（GAD65/67+）。這與之前的研究結(jié)果一致，即大多數(shù)對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)元是興奮性神經(jīng)元。然而，shEGFP+神經(jīng)元具有極高的異質(zhì)性，涉及到多種類型的神經(jīng)元，比如，其中膽囊收縮素陽性（Cholecystokinin+, CCK+）和生長(zhǎng)激素抑制素陽性（Somatostatin+, SST+）神經(jīng)元分別占18%和14%。值得注意的是，~1/3的shEGFP+神經(jīng)元表達(dá)了ErbB4，而ErbB4主要表達(dá)于興奮性神經(jīng)元中。

這些結(jié)果表明，傷害性熱刺激能夠激活一群ErbB4+興奮性神經(jīng)元。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者對(duì)ErbB4:: CreER;Ai9小鼠進(jìn)行熱刺激，該小鼠tdTomato的表達(dá)依賴于內(nèi)源性的ErbB4啟動(dòng)子。在脊髓中，ErbB4-tdT+神經(jīng)元主要集中在背角，分布于多層背角和脊髓外側(cè)核（Lateral Spinal Nucleus, LSN）中，然而，熱激活的ErbB4-tdT神經(jīng)元（cFos+）主要位于脊髓背角表層中。ErbB4-tdT神經(jīng)元約占cFos+神經(jīng)元33%。這些結(jié)果確認(rèn)了脊髓背角表層ErbB4+興奮性神經(jīng)元是一種新型的傷害性熱反應(yīng)細(xì)胞。

2. 脊髓ErbB4+，SST+和CCK+神經(jīng)元負(fù)責(zé)傷害性熱刺激感受

接下來，作者通過在ErbB4::CreER;LSL-EYFP（ErbB4-EYFP）小鼠椎管內(nèi)注射AAV-mCherry-DIO-dtA（AAV-dtA）病毒，在ErbB4+細(xì)胞中特異性的表達(dá)A型白喉毒素（diphtheria toxin subunit A, dtA）來消融脊髓中的ErbB4+神經(jīng)元。與注射對(duì)照病毒的小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠中EYFP+細(xì)胞和Nmur2+神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。接下來，小鼠接受了一系列的行為測(cè)試。與對(duì)照小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠在熱板以及哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中，后爪退縮和舔爪的潛伏期中增加了~40%，表明ErbB4+神經(jīng)元對(duì)傷害性熱刺激的感受至關(guān)重要。辣椒素能夠激活感覺神經(jīng)元中的TRPV1受體，誘發(fā)自發(fā)性疼痛，與對(duì)照組相比，在AAV-dtA注射的ErbB4-EYFP小鼠，辣椒素誘導(dǎo)的小鼠舔足次數(shù)減少了30%。這些結(jié)果表明，ErbB4+神經(jīng)元是傷害性熱刺激的感受所必需的。此外，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠對(duì)機(jī)械刺激、冰冷-溫?zé)?、以及癢刺激的反應(yīng)與對(duì)照類似。這表明脊髓ErbB4+神經(jīng)元可能不參與這些刺激的感受。

除了ErbB4+神經(jīng)元，SST+和CCK+中間神經(jīng)元也會(huì)被傷害性熱刺激激活。為了確定它們對(duì)熱刺激感受的貢獻(xiàn)，作者分別消融了這些神經(jīng)元。在熱板以及哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中，消融SST+神經(jīng)元后小鼠的反應(yīng)潛伏期分別增加了26%和22%，而消融CCK+神經(jīng)元的反應(yīng)潛伏期則沒有增加。值得注意的是，將ErbB4+、SST+和CCK+三類神經(jīng)元同時(shí)消融時(shí)，小鼠對(duì)傷害性熱刺激感受的抑制作用顯著增加到60% - 80%。這些結(jié)果表明，傷害性熱刺激感受涉及脊髓中的ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元。

3. ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+痛覺感受器的單突觸神經(jīng)支配，且能被傷害性熱刺激而非機(jī)械刺激所激活

不同的軀體感覺信息由不同類型的傳入纖維傳入脊髓背角：Aβ纖維主要用于傳遞非傷害性刺激，而Aδ和C纖維用于傳遞傷害性刺激。為了確定ErbB4+神經(jīng)元的信息來源，作者利用帶背根的縱向脊髓切片來記錄背角中ErbB4+神經(jīng)元的興奮性突觸后電流（EPSCs）。對(duì)于Aδ和C纖維的刺激傳入，分別有76%和54%的表層ErbB4+神經(jīng)元記錄到了EPSCs，其中67%和46%的ErbB4+神經(jīng)元為單突觸傳入。相比之下，表層中有25%的ErbB4+神經(jīng)元記錄到Aβ纖維信息傳入，只有9.1%是單突觸傳入。此外，在深層ErbB4+神經(jīng)元中，6.7%和5.6%的神經(jīng)元接受Aδ和C纖維的單突觸傳入。這些結(jié)果表明，淺表層的ErbB4+神經(jīng)元主要接受攜帶傷害性信息的C和Aδ纖維的單突觸傳入。

為了驗(yàn)證ErbB4+神經(jīng)元是否被TRPV1+傷害性感受器的突觸支配，作者用到了QX-314（一種細(xì)胞內(nèi)鈉通道抑制劑，其細(xì)胞進(jìn)入依賴于TRPV1的激活）。單獨(dú)使用QX-314對(duì)C纖維傳入的ErbB4+神經(jīng)元EPSC振幅影響不大。然而，在TRPV1激活物辣椒素存在的情況下，QX-314使EPSCs減弱，表明ErbB4+神經(jīng)元接受TRPV1+纖維的支配。與之一致的是，在QX-314和辣椒素的存在下，對(duì)C纖維刺激有反應(yīng)的ErbB4+神經(jīng)元的數(shù)量減少了。這種作用是C纖維特異性的，因?yàn)锳纖維中TRPV1表達(dá)較低，QX-314對(duì)刺激A纖維產(chǎn)生的EPSCs的影響不大。這些結(jié)果為表層ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+ C纖維的支配提供了藥理學(xué)依據(jù)。為了找到這種神經(jīng)支配的形態(tài)學(xué)證據(jù)，作者將AAV-DIO-mCherry注射到TRPV1::Cre;ErbB4::CreER小鼠脊髓腰膨大區(qū)標(biāo)記ErbB4+神經(jīng)元，并將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到DRG中標(biāo)記TRPV1+末端。脊髓切片用突觸后標(biāo)記物Homer進(jìn)行染色標(biāo)記?？梢钥吹紼rbB4+神經(jīng)元（mCherry+）被TRPV1+末端（即EYFP+）包圍。TRPV1+末端與Homer+突觸以及ErbB4+細(xì)胞密切相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元受到DRG中TRPV1+ 傳入纖維的支配。

為了證明這些突觸是有功能的，作者利用光遺傳學(xué)激活表達(dá)視蛋白ChR2的TRPV1+末端。42%的表層ErbB4+神經(jīng)元能夠在光刺激下誘發(fā)EPSCs，這些EPSCs被TTX所抑制，而在TTX和4-AP同時(shí)存在的情況下，仍有36%的ErbB4+表層神經(jīng)元能夠被光刺激誘發(fā)EPSCs，這表明它們是由DRG中TRPV1+傳入纖維的單突觸所支配的。綜上所述，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元直接受TRPV1+傷害性感受器的單突觸神經(jīng)支配。

為了確定ErbB4+神經(jīng)元是否對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生反應(yīng)，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到MrgprD::CreER;ErbB4::CreER小鼠DRG中，讓傳導(dǎo)機(jī)械刺激的MrgprD+神經(jīng)元表達(dá)ChR2，同時(shí)將AAV-DIO-mCherry注射到腰膨大來標(biāo)記ErbB4+神經(jīng)元。然而，對(duì)脊髓切片進(jìn)行光刺激，大多數(shù)的ErbB4+神經(jīng)元（87%）未能記錄到EPSCs，這表明大多數(shù)ErbB4+神經(jīng)元不接受來自機(jī)械刺激感覺神經(jīng)元的傳入。在3個(gè)響應(yīng)ErbB4+神經(jīng)元中，有2個(gè)被TTX和4-AP抑制，表明它們接受了多級(jí)突觸傳導(dǎo)，只有一個(gè)出現(xiàn)了4-AP增強(qiáng)的EPSCs，表明其受到機(jī)械感覺神經(jīng)元的單突觸支配。作為對(duì)照，作者采用了相同的策略來觀察SST+脊髓神經(jīng)元對(duì)機(jī)械感覺神經(jīng)元刺激的反應(yīng)。大多數(shù)記錄的SST+神經(jīng)元（72%）產(chǎn)生了光刺激誘導(dǎo)的EPSCs，表明它們接受MrgprD+機(jī)械感覺神經(jīng)元的傳入，且61%為單突觸支配。這些結(jié)果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元主要受傷害性熱刺激感受神經(jīng)元的支配，而非機(jī)械刺激感覺神經(jīng)元的支配。

為了進(jìn)一步表征在更接近生理?xiàng)l件下ErbB4+神經(jīng)元的敏感性，作者構(gòu)建了半完整的離體檢測(cè)范式，通過分離相連的部分脊髓、腰椎根、DRG、隱神經(jīng)和后肢皮膚，來記錄脊髓ErbB4+神經(jīng)元對(duì)皮膚刺激的反應(yīng)。在記錄的16個(gè)ErbB4+神經(jīng)元中，有9個(gè)（56%）對(duì)52℃刺激有反應(yīng)，有5個(gè)（30%）對(duì)0℃刺激有反應(yīng)。對(duì)15℃和40℃刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元分別為1個(gè)（7%）和2個(gè)（13%）。這些結(jié)果表明，表層ErbB4+神經(jīng)元對(duì)傷害性熱刺激的反應(yīng)較好，其次是冰冷刺激，而對(duì)涼或溫?zé)岽碳さ姆磻?yīng)較弱。為了確定ErbB4+神經(jīng)元是否對(duì)機(jī)械刺激有反應(yīng)，研究者用Von-Frey絲刺激皮膚。在16個(gè)記錄的神經(jīng)元中，有14個(gè)無反應(yīng)。這些結(jié)果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元對(duì)傷害性熱刺激比機(jī)械刺激更敏感。

4.抑制ErbB4+神經(jīng)元會(huì)減弱動(dòng)物對(duì)傷害性熱刺激的感受，反之則增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)熱刺激的感受

隨后，作者探討了脊髓ErbB4+神經(jīng)元活性對(duì)傷害性熱刺激感受的影響。為了降低ErbB4+神經(jīng)元的活性，作者將AAV-DIO-hM4Di-mCherry（AAV-hM4Di）注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大，并通過CNO來抑制ErbB4+神經(jīng)元活性。與對(duì)照相比，抑制ErbB4+神經(jīng)元增加了小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期，并減少了辣椒素誘導(dǎo)的舔足。抑制SST+而非CCK+神經(jīng)元，小鼠在熱板以及哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期增加，但對(duì)辣椒素誘導(dǎo)的舔足沒有影響。值得注意的是，當(dāng)這三類的神經(jīng)元活性同時(shí)降低時(shí)，小鼠對(duì)傷害性熱刺激感受的抑制效果增加60%~80%。這些結(jié)果表明脊髓ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元的活動(dòng)共同參與傷害性熱刺激感受，支持群體編碼模式理論。

為了增加脊髓ErbB4+神經(jīng)元的活性，作者將AAV-DIO-hM3Dq-mCherry注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大。與對(duì)照相比，激活ErbB4+神經(jīng)元降低了小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期，且增加了辣椒素誘導(dǎo)的持續(xù)舔足時(shí)間。表明， ErbB4+神經(jīng)元激活增強(qiáng)了動(dòng)物對(duì)傷害性熱刺激的感受。總之，這些結(jié)果揭示了ErbB4+神經(jīng)元在傷害性熱刺激感受中的關(guān)鍵作用。

5. 傷害性熱刺激的感受依賴ErbB4激酶的活性

ErbB4由生長(zhǎng)因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin 1, NRG1）所激活，為了檢測(cè)NRG1-ErbB4信號(hào)通路是否參與了傷害性熱感受，作者檢測(cè)了脊髓背角NRG1和pErbB4的表達(dá)。結(jié)果顯示，暴露于52℃熱板的小鼠其脊髓背角NRG1和pErbB4的表達(dá)增加，表明傷害性熱刺激可以增強(qiáng)脊髓背角的NRG1-ErbB4信號(hào)。接下來，作者評(píng)估了 ErbB4的存在對(duì)傷害性熱刺激的感受是否必要，為此，作者構(gòu)建了ErbB4-rKO小鼠（該小鼠在除心臟外的任何組織，包括脊髓中都不表達(dá)ErbB4）。值得注意的是，與對(duì)照組小鼠相比，ErbB4-rKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期增加，且辣椒素誘導(dǎo)的舔足次數(shù)減少，表明ErbB4在這些反應(yīng)中發(fā)揮了作用。隨后，為了消除其它組織中ErbB4突變可能存在的影響，作者通過在ErbB4f/f小鼠脊髓腰膨大注射了AAV-Cre-GFP病毒，來特異性的敲除脊髓背角中的ErbB4。與對(duì)照組相比，脊髓背角ErbB4敲除使得小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期增加，辣椒素誘導(dǎo)的舔足次數(shù)減少。這些結(jié)果揭示了ErbB4在傷害性熱刺激感受中的必要作用。

為了確定熱感受是否涉及ErbB4的激酶活性激活，作者以鞘內(nèi)注射的方式給小鼠注射阿法替尼（一種ErbB激酶抑制劑）。阿法替尼顯著減少了脊髓腰膨大中pErbB4的表達(dá)。動(dòng)物在熱板、哈格里夫斯和辣椒素實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)也減弱，但對(duì)針刺、掐和Von-Frey絲刺激反應(yīng)的影響不大。這些結(jié)果提示ErbB4激酶活性與傷害性熱刺激感受有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者對(duì)敲入突變株的T796G小鼠進(jìn)行了研究，在T796G小鼠中，ErbB4可以被體積較大的抑制劑1NMPP1特異性抑制。鞘內(nèi)注射1NMPP1可降低脊髓腰膨大中pErbB4的表達(dá)。在行為反應(yīng)測(cè)試中，1NMPP1顯示了類似阿法替尼的效果。總之，這些結(jié)果表明脊髓中ErbB4的激酶活性與傷害性熱刺激感受有關(guān)。

6. DRG中的NRG1參與了傷害性熱刺激的感受

為了確定傷害性熱刺激感受是否與內(nèi)源性NRG1有關(guān)，小鼠被注射了ecto-ErbB4（一種NRG1中和肽）。鞘內(nèi)注射ecto-ErbB4可減少脊髓中的pErbB4表達(dá)，并且增加小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期，減少辣椒素引起的舔足，但不會(huì)影響對(duì)針刺、掐和Von-Frey刺激的反應(yīng)。這些結(jié)果表明，內(nèi)源性NRG1參與了傷害性熱刺激的感受。

NRG1在DRG中大量表達(dá)，為了確定DRG神經(jīng)元中的NRG1是否參與熱感覺，作者構(gòu)建了advillin-CreER;NRG1f/f小鼠，通過給予他莫西芬，可以誘導(dǎo)小鼠感覺性神經(jīng)節(jié)中NRG1的條件性敲除（cKO）。與對(duì)照相比，cKO小鼠脊髓中的NRG1和pErbB4蛋白的表達(dá)均減少，NRG1 mRNA的水平在DRG中降低，但在脊髓中沒有顯著變化。cKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期增加，在辣椒素實(shí)驗(yàn)中的舔足次數(shù)減少。然而，脊髓中的NRG1敲低對(duì)熱刺激行為反應(yīng)或背角中的pErbB4幾乎沒有影響。這些結(jié)果表明DRG中的NRG1信號(hào)在傷害性熱刺激的感受中起作用。

7. NRG1-ErbB4信號(hào)能夠調(diào)控ErbB4+神經(jīng)元谷氨酸的傳遞

上述結(jié)果已經(jīng)證明，表層中c-Fos+ ErbB4+神經(jīng)元大部分是興奮性神經(jīng)元。為了確定NRG1和ErbB4是否能夠調(diào)節(jié)谷氨酸的傳遞，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒注射到ErbB4::CreER;Ai9小鼠中，在ErbB4+神經(jīng)元中特異性表達(dá)ChR2。在脊髓切片中，通過光刺激激活這些表達(dá)ChR2的ErbB4+神經(jīng)元，并在其鄰近的ErbB4-神經(jīng)元中記錄突觸后電流（PSCs）。在記錄的112 個(gè)ErbB4-神經(jīng)元中，當(dāng)膜電位鉗制在-70 mV時(shí)，其中31個(gè)神經(jīng)元記錄到了光刺激誘發(fā)的內(nèi)向電流；當(dāng)膜電位為0 mV時(shí)，所有神經(jīng)元均未記錄到光刺激誘發(fā)的外向電流，表明這些電流是EPSCs，而不是IPSCs。這些結(jié)果表明，表層的ErbB4+神經(jīng)元通過谷氨酸傳遞與下游神經(jīng)元進(jìn)行交流。事實(shí)上，這些EPSCs能夠被AMPA受體和NMDA受體抑制劑CNQX和AP-5阻斷。根據(jù)這些EPSCs對(duì)TTX和4-AP的潛伏期和阻抗，可以確定，半數(shù)下游神經(jīng)元接受ErbB4+神經(jīng)元的單突觸神經(jīng)支配。用生物素標(biāo)記這些記錄神經(jīng)元的形態(tài)特征也支持這一觀點(diǎn)。

接下來，作者確定了ErbB4+神經(jīng)元和靶細(xì)胞之間的谷氨酸傳遞是否受到NRG1-ErbB4信號(hào)通路的調(diào)控。在給予NRG1后的15分鐘內(nèi)，光刺激誘發(fā)的EPSCs的波幅顯著增加，而這種作用在洗脫后減弱，表明NRG1促進(jìn)谷氨酸傳遞。此外，給予ErbB4抑制劑阿法替尼降低了EPSC幅值，表明ErbB4激酶活性的參與谷氨酸傳遞。總之，這些數(shù)據(jù)證明了NRG1-ErbB4信號(hào)通路在脊髓谷氨酸傳遞中的作用。

8. NRG1-ErbB4信號(hào)通路參與病理性的熱痛過敏

在周圍神經(jīng)炎癥或損傷等病理?xiàng)l件下，機(jī)體對(duì)熱刺激的反應(yīng)更加敏感。在完全弗氏佐劑（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）引起炎癥性疼痛模型中，小鼠患肢在哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期顯著降低。以下證據(jù)能夠表明NRG1-ErbB4信號(hào)通路在炎癥引起的熱痛過敏中起作用。首先，NRG1和pErbB4在CFA注射小鼠的同側(cè)脊髓腰膨大中的表達(dá)增加。第二，在哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中，鞘內(nèi)中和NRG1能夠增加小鼠撤足的潛伏期。第三，阿法替尼能夠抑制野生型小鼠的熱痛過敏，1NMPP1能夠抑制T796G小鼠的熱痛過敏。

此外，作者還研究了該通路在慢性壓迫性損傷（Chronic Constriction Injury, CCI）誘導(dǎo)的熱痛過敏反應(yīng)中的潛在作用。CCI能夠誘導(dǎo)小鼠在哈格里夫斯實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)潛伏期降低，提示發(fā)生熱痛過敏。與假手術(shù)小鼠相比，CCI組小鼠同側(cè)腰膨大中NRG1和pErbB4的表達(dá)升高。野生型鞘內(nèi)給予ecto-ErbB4、阿法替尼、或T796G小鼠給予1NMPP1均可降低CCI引起的熱痛過敏。這些結(jié)果支持NRG1-ErbB4信號(hào)通路參與病理性的熱過敏的觀點(diǎn)。

總結(jié)

該研究通過分析熱刺激感受神經(jīng)元，識(shí)別出脊髓背角表層ErbB4在傷害性熱刺激的感受中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些ErbB4+神經(jīng)元顯示以下特性。首先，它們主要接收來自攜帶傷害性信息的Aδ和C纖維的單突觸傳入，而不是接受來自攜帶非傷害性信息的Aβ纖維傳入。其次，ErbB4+神經(jīng)元受DRG中TRPV1+傷害性傳入纖維的單突觸支配，對(duì)傷害性熱刺激反應(yīng)較好，而對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)較差。第三，消融或抑制ErbB4+神經(jīng)元減弱了動(dòng)物在熱板、哈格里夫斯以及辣椒素實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)，表明它們的活動(dòng)與傷害性熱刺激的感受有關(guān)。最后，文章證明了NRG1-ErbB4信號(hào)通路在生理?xiàng)l件下的傷害性熱刺激感受和病理?xiàng)l件下的熱痛過敏反應(yīng)中的作用。

亮點(diǎn)研究方法

這項(xiàng)工作闡述了脊髓ErbB4+神經(jīng)元在傷害性熱刺激感受中的作用機(jī)制。研究用到了動(dòng)物手術(shù)造模、行為學(xué)評(píng)估、光遺傳學(xué)、電生理記錄、組織病理檢測(cè)、給藥以及分子檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)，可提供該研究中涉及的動(dòng)物手術(shù)造模、行為學(xué)評(píng)估、光遺傳學(xué)、電生理記錄、組織病理檢測(cè)、給藥以及分子檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，客戶涵蓋700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力科研人員發(fā)表SCI文章12000+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.04.021