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  殺意綿綿 2017-12-16 00:00:00

  動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法 　　根據(jù)動物細(xì)胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 一、動物細(xì)胞生長特性及培養(yǎng)溫度 1、細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素 2、細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差 3、需氧少，不耐受QL通風(fēng)與攪拌 4、群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性） 5、培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高 6、原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡 依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，動物細(xì)胞可分為兩類： 貼壁依賴型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。 非貼壁依賴型細(xì)胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 　　培養(yǎng)細(xì)胞的Z適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的Z適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細(xì)胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡?？偟膩碚f，培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；細(xì)胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)；當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時，許多細(xì)胞將死亡。當(dāng)溫度下降到30~20℃時，細(xì)胞代謝降低，因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少。首先看到的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞從基質(zhì)上脫落下來。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時，它們原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平。 二、貼壁培養(yǎng)（attachment culture） 是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 1、生長特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。 2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點： 容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。 容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。 當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。 同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。 適用于所有類型細(xì)胞。 3、貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大； 不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長； 4、細(xì)胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。 5、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（后面ZT介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。 　　轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞Z初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。 　　轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點。 但也有其缺點：勞動強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。 現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類。 　　反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。 　　CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細(xì)胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)使用Z多方式，用于雜交瘤細(xì)胞、Hela細(xì)胞、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞及其它細(xì)胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種后貼壁快。 三、懸浮培養(yǎng)（suspension culture） 是指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)通起來的。 無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。 四、固定化培養(yǎng)（immobilization culture） 是將動物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。 1、吸附法:用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細(xì)胞固定化中Z早研究使用的方法。缺點是：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。 2、共價貼附法:利用共價鍵將動物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。 3、離子/共價交聯(lián)法:雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱為離子/共價交聯(lián)法（cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會使一些細(xì)胞死亡，也會產(chǎn)生擴(kuò)散限制。 4、包埋法:將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點是：步驟簡便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。缺點是：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于Z佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。 5、微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應(yīng)注意： 溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理條件下操作； 所用試劑和膜材料對細(xì)胞無毒害； 膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過； 膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

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