1、為什么實時熒光PCR法要用質(zhì)控

由于在樣本處理、核酸提取、PCR擴增整個過程中存在試劑/設備不穩(wěn)定、核酸提取效率低、樣本交叉污染等問題，所以需要設置質(zhì)控體系監(jiān)控核酸提取和PCR擴增全過程。質(zhì)控體系可以降低實驗誤差，保證樣本檢測的準確性，同時避免檢測過程中的假陰性和假陽性。

2、質(zhì)控體系質(zhì)控品的組成

陽性對照（PC）：監(jiān)控系統(tǒng)故障，一般為含目的成分或片段的質(zhì)粒。

陰性對照（NC）：監(jiān)控反應體系污染情況，一般為不含目的成分或片段的質(zhì)粒。

無模板對照（NTC）：監(jiān)控反應體系污染情況，一般為去離子水。

內(nèi)標（內(nèi)參）：校準生物學誤差，判斷核酸提取有效性及擴增效率。

重復實驗：降低其余誤差，一般為2-3次以上。

GB∕T38164-2019 動物源性成分檢測方法質(zhì)控品設置示例

動物源性檢測操作中對內(nèi)參基因18SrRNA進行檢測的方法可在第二通道中進行設置。單通道產(chǎn)品則可在B槽中進行，設置同A槽。 

3、質(zhì)控體系設置要求及過程控制

一般無特殊要求的實驗需要設置陰陽性對照，如非洲豬瘟病毒檢測（TCVMA 5-2018），食源性致病菌檢測等（SNT1870-2016），要求嚴格的實驗還需設置內(nèi)參并進行2-3個平行實驗，如動物源性檢測（GB∕T38164-2019），轉(zhuǎn)基因定量實驗等（GBT19495.5-2018）。

對于涉及人體樣本的臨床診斷而言，除質(zhì)控品設置外，還需對整個核酸提取和PCR擴增過程進行質(zhì)量控制。如諾如病毒檢測（GB 4789.42-2016），新冠病毒檢測等。

在實際實驗過程中，需綜合考慮實驗環(huán)境、操作流程、實驗成本等實際條件，以便選擇適宜的方法進行質(zhì)量控制。

（1）擴增控制示例（A5-A7）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 擴增控制示例

規(guī)則：YZ指數(shù)<2.00，擴增實驗成立，反之，則反應無效。

方法：YZ指數(shù)=A6Ct值-A5Ct值，滿足條件，則使用A1孔Ct值作為結(jié)果；若不滿足，則判斷A7Ct值-A5Ct值，滿足條件后則使用A2孔Ct值作為結(jié)果；若兩個反應孔YZ指數(shù)均≥2.00，則反應無效。（反應結(jié)果為陽性時也可酌情判定為陽性）

（2） 核酸提取過程控制（A8-B4）

GB 4789.42-2016 諾如病毒檢驗 核酸提取過程控制示例

規(guī)則：若核酸提取效率≥1%，則核酸提取有效。若提取效率<1%，則需重新檢測（反應結(jié)果為陽性時也可酌情判定為陽性）

方法：通過B1-B4孔建立標準曲線（PC2濃度為1）。核酸提取效率=A8孔Ct值對應的濃度×100%。

4、實時熒光PCR法診斷試驗的評價指標

（1）真實性評價

①：靈敏度：也稱真陽性率，即實際有病且按該診斷試驗被正確地判為有病的概率。

②：特異性：也稱真陰性率，即實際無病按該診斷試驗被正確地判為無病的概率。

③：假陰性率：也稱真陽性率，即實際有病但根據(jù)該診斷試驗被定為非病者的概率。

④：假陽性率：即實際無病但根據(jù)該診斷試驗被定為有病的概率。

 （2）可靠性評價

①：變異系數(shù)：當做定量試驗時，可用變異系數(shù)來表示可靠性，即所測平均數(shù)的標準差與測定的均數(shù)之比。

②：符合率：指同一批研究對象兩次診斷結(jié)果均為陽性與均為陰性的人數(shù)之和占所有進行診斷試驗人數(shù)的比率。