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  Ameiy2011 2017-06-11 00:00:00

  蛋白表達純化已經是非常經典簡單的實驗了，沒有LSS說的那么嚇人。 說說我的蛋白表達純化以及下面的單抗制作工作總體設計概要吧： 1 首先要知道你要純化蛋白的編碼DNA序列，查閱相關文獻，看目的基因在那些細胞或者組織中高表達，進而設計該基因的引物，擴增出目的DNA片段的ARF。這一布叫目的基因片段的獲取 2 構建表達載體：根據(jù)你獲得的基因本身的特性確定原核或者真核載體中表達，這一步的主要問題就是構建帶有目的基因的質粒，導入表達系統(tǒng)中。一般原核表達時間短，成本低，表達量大，常優(yōu)先考慮；但是有些基因在E coli中就是表達不出，可能是密碼子優(yōu)化等出現(xiàn)問題，也或者是由于想純化得到更好的活性蛋白的考慮（原核的蛋白折疊系統(tǒng)顯然沒有真核的好），有很多研究者選擇在畢赤酵母中表達。（我手里就有相關資料，因為以前做過表達純化及后來的單抗制備），這一步再強調一下，優(yōu)化密碼子對于蛋白的成功表達很重要 3 載體構建好了，下面就是重組蛋白的表達了。這一過程涉及到用多少的誘導劑，誘導多少時間才能得到Z多的蛋白的問題，即優(yōu)化表達條件。就是在上述不同量誘導劑誘導條件下，取菌體上清（分泌型）或者破碎細胞（胞內表達的蛋白）電泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白 4 蛋白表達成功，下面是根據(jù)蛋白質本身親水/疏水，電荷帶電特性等確定蛋白純化的方法。一般步驟：離心，取蛋白所在的相 如果是分泌表達的蛋白，則取上清，超濾，沒有超濾儀器可以用透析袋等代替，用離子交換柱層析?；旧线@一步能得到純化的95％的蛋白，電泳鑒定基本不會看到有雜帶出現(xiàn)。如果還是純度不符合要求，可以在表達蛋白Z初在構建表達載體質粒的時候在蛋白的ORF后面加上HIS－標簽，這樣得到的蛋白不但可以用于HIS柱的進一步純化，在不確定自己的融合蛋白是否有表達的時候，也可以單單用抗HIS的抗體做一WB，分析確認目的蛋白是否表達，這是蛋白表達的常用手段。 5 經過純化后的蛋白仍然含有一部分無機鹽，如果需要的話可以將蛋白經真空凍干機凍干，得到純蛋白。 我們實驗室做出來的一個蛋白，編碼序列GC含量高75達％，但是功夫不負有心人，只要你想做那件事情，積極的尋找解決問題的手段，總會搞定的，沒有跨不過的坎。如果坎太寬，搭橋解決總行。

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