導(dǎo)讀

說起引物，大家都再熟悉不過了。引物，在核苷酸聚合作用的起始時(shí)，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量PCR，設(shè)計(jì)合適的引物是非常關(guān)鍵的一步。

普通PCR和熒光定量PCR的檢測(cè)方式具有較大的差別。熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過檢測(cè)插入DNA中核酸染料的量來測(cè)定PCR產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)方面，有什么相同點(diǎn)和不同點(diǎn)呢？今天小編就給大家匯總一下。

相同處：

?  序列的查找是一致的。

?  序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。

?  選取合適的擴(kuò)增片段大小。

?  避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)。

?  避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

? Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。

?  引物之間的Tm相差避免超過2℃。

?  引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。

不同處：

熒光定量PCR 引物

?  PCR產(chǎn)物長度：要求在300bp以內(nèi)，一般選80-150bp之間。

?  引物特異性：對(duì)引物要求高，盡量減少引物二聚體的產(chǎn)生，熔解曲線要求單一產(chǎn)物。

?  擴(kuò)增效率：熒光定量 PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對(duì)定量，擴(kuò)增效率應(yīng)在90%—110%之間。

?  多對(duì)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來的引物條件會(huì)不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物。

?  目的基因含量比較低時(shí)，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物。

普通PCR 引物

?  普通PCR的擴(kuò)增長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。

?  相對(duì)于熒光定量PCR，普通PCR對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)要求較低。

?  對(duì)擴(kuò)增效率要求不高。

?  可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對(duì)引物退火溫度要求不需要一致。

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Harness of the power of qPCR

?   數(shù)據(jù)可靠性：連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致。

?  應(yīng)用靈活性：提供多種qPCR應(yīng)用分析。

?   流程智能化：中英文用戶界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   在線便捷性：主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，數(shù)據(jù)可USB、Wi-Fi等網(wǎng)絡(luò)傳輸。