一、熒光基礎知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術中具體體現(xiàn)為以下幾個關鍵部件：

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標

? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團在特定波段范圍才能被大部分激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團激發(fā)特征。

? 發(fā)射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強信號的發(fā)射熒光信號。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

? 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

? 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團發(fā)射的特定波段的光通過

? 二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家品牌，不同波段需求的激發(fā)塊）

二、熒光顯微成像的應用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學）、礦物、材料科學等領域的顯微熒光觀測。①在生物學領域，主要借助熒光染料標記，可準確和詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分。②在礦物學領域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導體領域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術在生物學領域中應用是廣泛也是復雜的，主要是對細菌、細胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進行標記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進行標記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標記的位置，二是該染料對應的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對核酸、聚糖進行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據(jù)染料結合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術利用抗體可以和相應抗原特異性結合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號，即通過克隆技術用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標記的抗體與目的蛋白特異性結合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團結合，主要用于免疫熒光和流式細胞術中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標記顯影時背景弱，信號強。除細胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學顯影、小動物體內(nèi)成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標識涵蓋了對應的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對核酸進行標記與研究同樣有重要意義，如對細胞核（主要成分為核酸）進行染色標記可以判斷細胞的數(shù)量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當DAPI與雙股DNA結合時，在358nm處有一個吸收峰值，在461nm處有一個發(fā)射峰值，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結合的結果。DAPI可以透過完整的細胞膜，因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細胞膜，被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細胞膜的DNA染色劑。與核酸結合后，激發(fā)波長為538 nm，發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進入完整的細胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細胞群中的活細胞和死細胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細胞中各種離子的流動與分布對細胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結合形成熒光團，利用光譜特征檢測對應離子的分布狀態(tài)。

三、熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應用熒光顯微技術進行成像的過程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術應用中的常見挑戰(zhàn)與應對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強，但使用有很多麻煩，首先需要預熱，然后光強靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強衰減問題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四家品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四家品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四家品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學領域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內(nèi)的有機分子在與氧反應時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)時間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

（單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學領域應用較多，尤其是在對活細胞標記成像時，需同時對多種物質(zhì)進行標記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標記時會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應對思路，一是針對每種染料使用對應的單通道窄帶濾光片，后通過軟件進行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現(xiàn)一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號）

來源：https://www.mshot.com/article/1527.html

納米銀粒子很小，才幾十納米，通常會用到電子顯微鏡。不過，此次，香港中文大學老師只需要觀察納米銀顆粒分布，不需要清晰觀察細節(jié)，同時后期需升級熒光觀察，因此深圳區(qū)域工程師推薦了金相顯微鏡MJ43BD搭配2000萬像素顯微鏡相機MDX10，現(xiàn)場演示了金相樣品效果，獲得用戶認可。

金相顯微鏡MJ43，配備半復消色差的明暗場物鏡和六孔轉盤式落射模塊，具備良好的成像質(zhì)量和擴展能力，對于功能和擴展要求更高的老師很適合，標配支持明場和暗場觀察，根據(jù)工業(yè)和材料學的不同應用，還能通過模塊化組合，實現(xiàn)偏光、熒光、DIC等觀察方式。

金相顯微鏡MJ43可應用于半導體、FPD、電路板、金屬材料等制造領域，適用于教學及研究方面

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來源：https://www.mshot.com/article/1741.html

倒置熒光顯微鏡MF52-N應用于細胞

幾年來科學家正在開發(fā)細胞療法，希望能治療多種疾病和疑難雜癥。這就需要質(zhì)量控制和各種有關儀器設備來支持免疫療法和再生醫(yī)學的發(fā)展。近期，明美上海區(qū)域安裝倒置熒光顯微鏡MF52-N，觀察mcherry熒光，應用于細胞治療。

倒置熒光顯微鏡MF52-N下，細胞均勻分布，生長狀態(tài)良好。作為一種新興的治療方式，細胞治療在眾多疾病特別是癌癥、遺傳疾病、傳染病的治療中展現(xiàn)出良好的效果。而明美倒置熒光顯微鏡MF52-N為治療提升效率與提高準確性。

倒置熒光顯微鏡MF52-N配備數(shù)顯LED熒光模塊，可實現(xiàn)三通道熒光激發(fā)，可選BGUYR等不同通道，激發(fā)光強直觀可視并獨立記憶，可用于細胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等科研應用。

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倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細胞是一種重要的實驗方法，用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細胞時，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進行免疫熒光顯微鏡觀察細胞時，需要選擇合適的熒光強度和熒光顏色，以避免對觀察結果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠光學設計和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等領域。

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來源：https://www.mshot.com/article/1810.html

文昌魚是文昌魚屬（Branchiostoma）動物的總稱， 又稱蛞蝓魚。形似小魚，無頭，兩端尖細，是無脊椎動物進化至脊椎動物的過渡類型，也是研究脊索動物演化和系統(tǒng)發(fā)育的優(yōu)良科學實驗材料，具重要科學價值，一般觀察這種文昌魚采用什么顯微鏡觀察呢？

體視顯微鏡下觀察的文昌魚

常規(guī)文昌魚觀察用體視顯微鏡較多，但個別熒光觀察，還會用到體視熒光顯微鏡。體視顯微鏡采用優(yōu)質(zhì)光學系統(tǒng)設計，展現(xiàn)優(yōu)異的分辨率及真實色彩，人機工程學設計和耐用的機身部件，長時間使用穩(wěn)定可靠。是常規(guī)生物醫(yī)學檢驗，科研研究和工業(yè)檢測等高精度觀察領域的理想工具。

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【本文的標題和網(wǎng)址】文昌魚一般用什么顯微鏡觀察？；http://www.mshot.com/article/868.html