顯微共聚焦拉曼光譜技術

顯微拉曼光譜技術是將拉曼光譜分析技術與顯微分析技術結合起來的一種應用技術。其原理是使光源、樣品、探測器三點共軛聚焦，消除雜散光，信號增強104-105倍。原理：從點光源發(fā)光通過透鏡聚焦到被測物體上，若物體恰在焦點上，那么發(fā)射光通過透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦。

便攜式拉曼光譜技術

便攜式拉曼光譜儀滿足現(xiàn)場測試的需求，具有質量輕，體積小，且容易攜帶等特點，已成為當今拉曼光譜儀的發(fā)展新方向。一般我們釆用光強大、方向性強和單色性好的窄帶半導體激光器作光源，由光柵、系統(tǒng)光路和CCD電路系統(tǒng)完成釆集，PC端或嵌入式系統(tǒng)完成界面交互和上層操作，便于在現(xiàn)場使用。

手持式拉曼光譜技術

手持式拉曼光譜系統(tǒng)基于市場快速檢測的需求，具有較好分辨率、靈敏度，滿足日常應用。手持式拉曼光譜儀由激光器、光譜儀、探測器、微處理系統(tǒng)和待測樣品區(qū)組成。一般要求小型化，質量<1kg，具有數(shù)據(jù)比對功能，可實現(xiàn)物質的快速鑒別。 

表面增強拉曼光譜技術

當分子被吸附到某些粗糙的金屬表面上時，拉曼散射強度會極大的增強，科學界把這一現(xiàn)象命名為表面增強拉曼散射效應，簡稱SERS。 表面增強拉曼可以觀測化學反應過程，實現(xiàn)單分子檢測

共振拉曼光譜技術

當激發(fā)頻率接近或重合于分子的一個電子吸收峰時，某特定的拉曼帶強度會急劇增加，達到正常拉曼帶強度的百萬倍，并出現(xiàn)強度可與基頻相比擬的泛音及組合振動，這就是共振拉曼效應(簡稱RRE)。共振拉曼可選擇性的激發(fā)某些組分信息，得到特定組分的共振拉曼光譜

       離心機是繞固定旋轉軸旋轉的物體受離心力產(chǎn)生模擬地球重力場的作用，使物體做沉降運動，從而對物質中的不同密度、不同分子的級分進行分離的儀器設備。應用離心沉降進行物質的分析和分離的技術就稱為離心技術。實驗室離心機是利用旋轉轉頭產(chǎn)生的離心力，使懸浮液或乳濁液中不同密度、不同顆粒大小的物質分離開來，或在分離的同時進行分析的儀器。

1.按結構形式可分為臺式離心機、落地式離心機

（1）臺式離心機主要用于懸浮液中的固液分離；或將乳濁液中兩種密度不同，又互不相溶的液體分開(；它也可用于排除濕固體中的液體；特殊的超速管式分離機還可分離不同密度的氣體混合物；利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點，有的沉降臺式離心機還可對固體顆粒按密度或粒度進行分級。

（2）落地式離心機具有體積小容量大等特點，性能穩(wěn)定、速度可調并能自動調節(jié)平衡、溫升低、使用效率高以及適用性廣等優(yōu)點。該產(chǎn)品廣泛應用于醫(yī)藥制品、血站、臨床試驗等領域。

2.按轉速分類可分為低速離心機、高速離心機、超速離心機、超高速離心機

（1）低速離心機可廣泛應用于生物化學、免疫學等領域，是實驗室中用于離心沉淀的常見儀器。

（2）高速離心機的轉速一般在10000～30000r/min之間，并且?guī)в兄吕湎到y(tǒng)。屬常規(guī)實驗室用離心機，廣泛用于生物，化學等科研教育和生產(chǎn)部門 ，它通過利用轉子高速旋轉產(chǎn)生的強大離心力，分離液體與固體顆粒或液體混合物中各組分，適用于微量樣品快速分離合成。

（3）一般說，超速離心機離心機轉速在30 000r/min以上。

3.按用途可分為工業(yè)用實驗室離心機和醫(yī)用實驗室離心機。

（內容來源于網(wǎng)絡）

什么是拉曼

光照射到物質上發(fā)生彈性散射和非彈性散射. 彈性散射的散射光是與激發(fā)光波長相同的成分，成為瑞利散射；非彈性散射的散射光有比激發(fā)光波長長的和短的成分, 稱為拉曼散射（斯托克斯及反斯托克斯拉曼散射）。拉曼散射大約只占散射光的千萬分之一，這些散射散布到四面八方，而且它們的波長和偏振態(tài)都會發(fā)生改變。
拉曼效應是光子與光學支聲子相互作用的結果，源于分子振動（和點陣振動）與轉動，因此從拉曼光譜中可以得到分子振動能級（點陣振動能級）與轉動能級結構的信息。
斯托克斯拉曼散射光子能量比瑞利散射光子能量弱，即斯托克斯拉曼散射光的波長比瑞利散射光的波長長；而反斯托克斯拉曼散射光子具有更高的能量。反斯托克斯譜線強度比斯托克斯譜線強度弱得多，這是因為只有處于振動激發(fā)態(tài)的分子引起的輻射才能產(chǎn)生反斯托克斯譜線。相對來說，在拉曼實驗中，斯托克斯譜線更容易被測量到。

幾種常見的拉曼技術

共振拉曼(RRS) 

如果激光的波長和分子的電子吸收相吻合，這一分子的某個或幾個特征拉曼譜帶強度將增至100-10,000 倍以上，并觀察到正常拉曼效應中難以出現(xiàn)的、其強度可與基頻相比擬的泛音及組合振動光譜。這種共振增強或共振拉曼效應非常有用，不僅能顯著降低檢測限，而且可引入電子選擇性。由于共振拉曼能提供結構及電子等信息，因此，共振拉曼也被用于物質鑒定。

紫外共振拉曼(UVRRS) 

熒光干擾問題和靈敏度較低嚴重阻礙了常規(guī)拉曼光譜的廣泛應用。但近年來發(fā)展起來的紫外拉曼光譜技術有效地解決了上述問題。紫外拉曼光譜技術的出現(xiàn)和發(fā)展大大地擴展了拉曼光譜的應用范圍。右圖是紫外拉曼光譜避開熒光干擾的原理圖。熒光往往出現(xiàn)在300 nm-700 nm 區(qū)域，或者更長波長區(qū)域。而在紫外區(qū)的某個波長以下，熒光極少出現(xiàn)。因此，對于許多在可見拉曼光譜中存在強熒光干擾的物質，例如氧化物、積碳等， 通過利用紫外拉曼光譜技術就可以成功的避開熒光從而得到信噪比較高的拉曼譜圖。從下圖磷酸鋁分子篩ALPO-5 示例可以看出，紫外共振拉曼光譜技術由于能避開熒光，可以成功用于微孔和介孔分子篩材料的表征。

紫外拉曼光譜技術的另一個突出特點是，拉曼信號可以通過共振拉曼信號得到增強。共振拉曼效應可以從拉曼散射截面公式得到解釋：根據(jù)Kramers-Heisenberg-Dirac 散射公式:

 
在公式 (1) 中，ωri 是初始態(tài)i 到激發(fā)態(tài)r 的能量差頻率，ωL 是入射激光頻率。當激發(fā)光源頻率靠近電子吸收帶時，diyi項分母趨近于零，因而其散射截面異常增大, 導致某些特定的拉曼散射強度增加104~106 倍。共振拉曼光譜的譜峰強度隨著激發(fā)線的不同而呈現(xiàn)出與普通拉曼不同的變化。

紫外拉曼光譜規(guī)避熒光成功表征AIPO-5 分子篩的信號

將紫外共振拉曼用于表征多組份體系時，可以選擇性的激發(fā)某些組分相應的信息，從而使與這些組分相關的拉曼信號大大增強，得到共振拉曼光譜
這種共振增強或者共振拉曼效應是非常有用的一個技術，它不僅可以極大的降低拉曼測量的探測極限，而且還可以引入到電子選擇上面。這樣，如果我們使用共振拉曼技術來研究樣品，不僅可以看到它的結構特征，而且還可以得到它的電子結構信息。金屬卟啉， 類胡蘿卜素以及其他一系列生物重要分子的電子能級之間躍遷能量差都處在可見光范圍之內，這使得它們成了共振拉曼光譜的理想研究材料。

拉曼散射和共振拉曼散射的能級圖以及它們對應拉曼譜圖示意圖

共振選擇技術還有一個非常實際的應用。那就是二分之一載色體的光譜由于這種共振作用會得到增強，而它周圍的環(huán)境則不會。對于生物染色體來說這就意味著，我們使用可見光即可特定的探測到有源吸收ZX，而它們周圍的蛋白質陣列則不會對探測產(chǎn)生影響（這是因為這些蛋白質需要紫外光才能使其產(chǎn)生共振增強作用）。共振拉曼光譜在化學上探測金屬ZX合成物，富勒分子，聯(lián)乙醯以及其他的稀有分子上也是一種重要的技術，因為這些材料對于可見光都有著很強的吸收。

其他更多的分子吸收光譜由于處于紫外，所以需要紫外激光進行共振激發(fā)，我們就稱之為紫外共振拉曼（Ultra Violet Resonance Raman Spectroscopy）; 紫外共振拉曼光譜技術是研究催化和復雜生物系統(tǒng)中分子分析的一個重要工具。大多數(shù)的生物系統(tǒng)都吸收紫外輻射， 所以它們都能提供紫外的共振拉曼增強。這樣高的共振拉曼共振選擇效應使得像蛋白質和DNA 等重要生物目標的拉曼光譜得到極大增強， 而其他物質則不會，非常便于目標確認及分析。例如，200nm 的激發(fā)光能夠增強氨基化合物的振動峰；而220nm 的激發(fā)光則可以增強特定的芳香族殘留物的振動峰。水中的拉曼散射非常弱，這個技術使得與水有關的微弱系統(tǒng)的拉曼分析也變成了可能。

金屬卟啉、類胡蘿卜素以及其他幾類重要的生物分子在可見光區(qū)域內有強烈的電子躍遷，因此他們成了理想的共振拉曼光譜檢測對象。

表面增強拉曼（SERS）

自1974 年Fleischmann 等人發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙化的Ag 電極表現(xiàn)的吡啶分子具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象，加之活性載體表面選擇吸附分子對熒光發(fā)射的YZ，激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高，這種表面增應被稱為表面增強拉曼散射(SERS)。
拉曼散射由化合物（或離子）的散射吸附，或在結構化金屬表面，可達到溶液中散射的103 倍到106 倍。這種表面增強拉曼散射在銀表面表現(xiàn)得強，在金或銅表面也比較強。其他金屬則沒有這么強的增應。

表面增應產(chǎn)生的兩個機制：

diyi種是在貴金屬表面產(chǎn)生一種增強的電磁場。當入射光的波長接近金屬等離子體波長時，金屬表面?zhèn)鲗щ娮颖患ぐl(fā)到一個擴展表面的電子激發(fā)態(tài)，稱為表面等離子體共振。分子吸附在表面或接近表面經(jīng)過一個異常大的電磁場。垂直于表面的振動模式帶來的增強強烈。
第二種是是在表面和分析物分子之間形成電荷轉移絡合物。許多電荷轉移絡合物帶來的電子躍遷會產(chǎn)生可見光，以便發(fā)生增強諧振。

顯微共聚焦拉曼（Confocal）

共焦：從一個點光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源， 這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦指的是空間濾波的能力和控制被分析樣品的體積的能力，通常是利用顯微鏡系統(tǒng)來實現(xiàn)的。只有顯微鏡系統(tǒng)的無限遠光路才可以實現(xiàn)良好的共焦性能。
顯微拉曼光譜技術是將拉曼光譜分析技術與顯微分析技術結合起來的一種應用技術。與其他傳統(tǒng)技術相比，更易于直接獲得大量有價值信息，共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規(guī)拉曼光譜的特點，還有自己的獨特優(yōu)勢，樣品區(qū)接近衍射極限（約1 微米）；成像和光譜可以被組合以產(chǎn)生“拉曼立方體”三維數(shù)據(jù)，在二維圖像的每個像素對應一個拉曼頻譜信息。
從光學結構來說，顯微共聚焦拉曼光譜儀主要有針孔共聚焦和“狹縫-CCD”共聚焦兩種設計結構。
先進的“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術，具有較高通光效率，高靈敏度，操作簡單。
原理：顯微鏡頭聚焦到樣品上，將顯微鏡頭收集的樣品信號聚焦到光譜儀狹縫入口，通過狹縫對焦平面的一維（X 方向）限制進入光譜儀； 經(jīng)光譜儀分光，光譜成像在CCD 上；在通過對CCD 上像元的提取， 對另一維（Y 方向）的信號的限制，提取出樣品上的信號，實現(xiàn)共焦作用?！蔼M縫+CCD 焦平面共焦”技術特點：
1、 共焦區(qū)域任意設置（狹縫寬度，CCD 像元區(qū)域任意設定）。
2、 全部信號進入光譜儀，沒有信號損失。
采用“狹縫+CCD焦平面共焦”技術的Finder Vista（“微曼”共聚焦拉曼顯微鏡）空間分辨率指標：
 X，Y方向空間分辨率：1um
 Z方向空間分辨：2um

典型拉曼光譜系統(tǒng)架構

典型拉曼光譜系統(tǒng)由如下幾個部分構成：

 激發(fā)光源。通常采用激光器，要求單色性好、功率大并且Z好能選擇多個工作波長。
 激發(fā)光路。包含聚焦、匯聚、濾光等多個功能元件以及樣品調節(jié)裝置。
 光譜儀?？蒲屑壍南到y(tǒng)中通常采用高分辨率光譜儀， 推薦采用影像校正光譜儀，可以進一步提升系統(tǒng)的檢測性能。
 探測器。通常采用CCD探測器或高靈敏度的PMT（配合光子計數(shù)器等高靈敏電子學設備）。
 數(shù)據(jù)處理單元。包括計算機和軟件。

拉曼光譜應用

拉曼光譜能給出的物質信息