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  簭翉aZ蹛P 2011-12-25 00:00:00

  http://baike.baidu.com/view/346553.htm

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  13834748909 2012-01-07 00:00:00

  一、制備顯微標(biāo)本的切片法 一石蠟包埋切片制作法 這是Z常用的切片法。以石蠟作為組織的填充支持介質(zhì)，將整塊組織加以包埋，Z后凝固成均勻一致的固態(tài)結(jié)構(gòu)。用切片機(jī)制取極薄的切片。為了讓石蠟?zāi)芙虢M織內(nèi)部，需將組織經(jīng)過(guò)脫水等處理。過(guò)程大致如下： ⑴固定：生物標(biāo)本脫離機(jī)體或培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞會(huì)發(fā)生自溶，腐敗分解。因此，需用固定劑處理，使蛋白質(zhì)凝固停止瀕死或死后變化。凡供保存的標(biāo)本都需經(jīng)固定處理。 常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質(zhì)凝固。還有由幾種試劑配成的固定液，例如Carnoy固定液，由無(wú)水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強(qiáng)，不含水分，可避免水溶性物質(zhì)如糖原等在固定過(guò)程中損失。 ⑵脫水：是將組織細(xì)胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），濃度遞升到 。此過(guò)程還使組織塊進(jìn)一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于純酒精又能融解石蠟的有機(jī)溶劑，將組織中的酒精取代，以便石蠟浸入。通常用二甲苯（xylene）為透明劑。 ⑷浸蠟：在溫箱內(nèi)進(jìn)行。已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組織，作為支持介質(zhì)。 ⑸包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包埋。 ⑹切片：用切片機(jī)。常用的切片機(jī)有輪轉(zhuǎn)式、平推式的。用輪轉(zhuǎn)式的易于切出連續(xù)切片。切片厚度隨制片目的而調(diào)整。教學(xué)標(biāo)本厚度多是5~6μm。 ⑺貼片烤干：石蠟切片在溫水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色處理。染色后用樹(shù)膠、蓋坡片封固，可保存。 二冷凍切片法 冷凍切片法是借組織在低溫下，凍結(jié)變硬而達(dá)到符合切片要求。冷凍切片法需有冷凍切片機(jī)，或在普通切片上配制冷設(shè)施。恒冷切片機(jī)是高級(jí)冷凍切片設(shè)備。它有一個(gè)恒冷箱，標(biāo)本致冷臺(tái)和切片機(jī)都裝在箱內(nèi)。恒冷箱的作用類似冰箱，可在一定范圍內(nèi)調(diào)整溫度，其結(jié)構(gòu)有利于保持箱內(nèi)恒定低溫，減少箱門打開(kāi)時(shí)環(huán)境溫度的干擾。切片機(jī)的輪轉(zhuǎn)把手裝在箱外，便于操縱切片。 冷凍切片法的優(yōu)點(diǎn)是：在處理得當(dāng)時(shí)，它可以Z大限度地保持組織的新鮮狀態(tài)。并且，由于不需經(jīng)脫水、透明、浸蠟等過(guò)程中有機(jī)溶劑的處理，及濕箱浸蠟熱的影響，甚至可不經(jīng)固定。所以能很好地保存組織細(xì)胞的各種成分和酶的活性，因此在酶的組織化學(xué)研究中常用此切片法。 二、顯示標(biāo)本結(jié)構(gòu)成分的染色法 一蘇木素伊紅染色法（HE染色法） 為Z常用的染色法。該法應(yīng)用于各種組織的染色，是組織學(xué)技術(shù)的基本方法，對(duì)任何液體固定的組織和各種包埋的切片均可使用，只是對(duì)不同包埋的切片法處理略有不同。下面簡(jiǎn)介石蠟包埋切片的HE染色法。 1、脫蠟：石蠟切片的組織內(nèi)部充滿石蠟，不能使水溶性染液著色，因此在染色前必須首先用二甲苯將石蠟脫掉，共兩次。 2、下行入水：將已脫蠟的標(biāo)本浸入無(wú)水酒精及各級(jí)酒精，使組織逐步接近水。3、蒸餾水略洗。 4、蘇木素溶液染色約5—15分鐘 5、自來(lái)水洗去多余染料。 6、入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，細(xì)胞質(zhì)無(wú) 色為合適。 7、分色后用自來(lái)水或加數(shù)滴氨水堿化，直至細(xì)胞核變成藍(lán)色。這一步驟也可稱為“藍(lán)化”。 8、入蒸餾水洗去堿性水分。 9、入70%酒精→80%酒精各5分鐘。 10、入伊紅染液染色30秒至數(shù)分鐘。 11、以95%酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿，結(jié)締組織等呈桃紅色。 12、上行脫水：染色后的切片，因組織內(nèi)含水而不透明，不能清晰地觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，須將組織內(nèi)的水分經(jīng)各級(jí)酒精→無(wú)水酒精逐步置換，Z后進(jìn)入不含水份的透明劑內(nèi)。 13、透明：入二甲苯透明劑，二次（各數(shù)分鐘）。 14、取出切片：將組織周圍多余的二甲苯擦去，滴樹(shù)膠后加蓋玻片封固。 結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)紫色，胞漿、膠原纖維、肌纖維為桃紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅色，彈性纖維呈明亮桃紅色。 二組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)，是將物理和化學(xué)的技術(shù)運(yùn)用到組織標(biāo)本，用顯微鏡和化學(xué)分析方法來(lái)研究組織和細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分，并觀察該化學(xué)成分在組織、細(xì)胞內(nèi)的定位、含量及其變化規(guī)律。這些化學(xué)成分借著化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的不溶性著色物質(zhì)來(lái)顯示。對(duì)于某些化學(xué)成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或間接的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生著色沉淀而顯示其部位和相對(duì)含量。對(duì)于酶類，顯示它的活性，須有該種酶的底物（被該種酶作用的物質(zhì)），由酶對(duì)底物的分解，直接或間接地生成著色物質(zhì)而被顯示。凡是在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞原位顯示的化學(xué)物質(zhì)，稱組織化學(xué)，若用電鏡觀察細(xì)胞原位化學(xué)成分的著色部位，則稱電鏡細(xì)胞化學(xué)，下面從原理方面簡(jiǎn)要介紹幾種常用的組織化學(xué)染色技術(shù)： 1、顯示琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的硝基-BT法： （Succinate dehydrogenase） ⑴酶的定位及生物學(xué)意義： 琥珀酸脫氫酶是線粒體標(biāo)志酶，其存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，和線粒體內(nèi)膜緊密結(jié)合。該酶不需輔酶而自身有黃素蛋白（FP，F(xiàn)lavoprotein）為輔基。在組化反應(yīng)中常用來(lái)反映三羧酸循環(huán)的情況。其催化過(guò)程如下： 弱-單甲（紫紅色） HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2四唑（甲）↓ （有色）強(qiáng)-雙甲（深紫藍(lán)色） （琥珀酸）（黃素蛋白） HOOC-CH=CH=COOHFPH2四唑（無(wú)色） （延胡索酸） ⑵原理：上述的反應(yīng)Z后一步的原理是，硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮藍(lán)）系異環(huán)族化合物四唑鹽，當(dāng)它接受氫時(shí)，本身被還原為有色沉淀產(chǎn)物（甲 ）（Formazan）。 ⑶孵育液配制： A液（貯備液） 0.2M磷酸緩沖液（PH7.6）10ml等量混合 0.2M琥珀酸鈉（S01.succinate） 10ml備用 B液： 硝基四唑（Nitro-Br）2mg 2ml 0.2M磷酸緩沖液（PH7.6） 2ml 取：A液2ml B液2ml孵育液 聚乙烯吡烷酮（PVP） 300mg ⑷方法： ①新鮮恒冷箱冷凍切片，厚6~8μm，平貼在蓋玻片上。 ②滴染法：將有冷凍切片的蓋玻片（標(biāo)本面朝上）平放于預(yù)熱好的培養(yǎng)皿中（底部墊一濕濾紙），滴加孵育液至全部覆蓋組織，于37℃溫箱中孵育45~60分鐘（肝，心肌組織15分鐘即可）。 ③于生理鹽水中沖洗二次（輕晃，以防脫片）。 ④10%生理鹽水固定10分鐘。 ⑤15%酒精浸洗5分鐘（換二次）。 ⑥甘油明膠封片。 ⑸結(jié)果：酶活性強(qiáng)處呈藍(lán)色顆粒（雙甲沉淀），酶活性較低時(shí)形成紫紅色單甲。在光鏡下，該酶活性于肝小葉內(nèi)分布呈明顯分帶現(xiàn)象，周邊帶強(qiáng)于ZY帶。在心肌細(xì)胞縱切面，酶活性顆粒沿心肌細(xì)胞長(zhǎng)軸整齊排列，相鄰心肌細(xì)胞的空白處為閏盤(pán)。 2、顯示葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的鉛法： （Glucosel-phosphate phosphohydrolase） ①酶的定位及其生物學(xué)意義： 該酶主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志酶。G-6-Pase參與糖代謝，能水解葡萄糖-6-磷酸而釋放出葡萄糖和磷酸。 ⑵原理：G-6-Pase將底物（葡萄糖-6-磷酸鉀鹽）水解產(chǎn)生磷酸離子，后者被孵育液中的硝酸鉛所捕獲，Z終反應(yīng)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀，其反應(yīng)式如下： 酶Pb(NO3)2 葡萄糖-6-磷酸鉀+H2O葡萄糖+磷酸 (NH4)2S Pb2(PO4)2PbS↓ (無(wú)色)（棕色） （試劑配制及方法詳見(jiàn)組織學(xué)技術(shù)專著） ⑶結(jié)果：酶活性部位呈棕色硫化鉛顆粒沉淀。在光鏡下G-6-Pase活性顆粒較均勻地分布于胞質(zhì)中。 3、顯示堿性磷酸酶（APL）的鈣鈷法（Alkaline phosphohydrolase） ⑴酶的定位及其生物學(xué)意義： ALP在堿性環(huán)境下能催化各種醇和酚的磷酸酯水解，參與磷酸根的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，并有磷酸轉(zhuǎn)移的作用，故在細(xì)胞膜上運(yùn)輸較活躍，如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎近曲小管刷狀緣，腸上皮紋狀緣等處，該酶的活性較高。 ⑵原理：ALP將磷酸鹽底物（如β-甘油磷酸鈉等）分解產(chǎn)生磷酸根離子，后者為孵育液中的氯化鈣捕獲生成磷酸鈣沉淀，但該沉淀為非金屬鹽，需加入硝酸鈷，使其生成磷酸鈷沉淀，因無(wú)色，再需通過(guò)硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷沉淀而被顯示。在PH9.2—9.4環(huán)境中表現(xiàn)Z大活性。反應(yīng)式如下： ALPCa++ β-甘油磷酸鈉磷酸離子Ca2(PO4)2 Co(NO3)2(NH4)2S CO2（PO4）2CoS↓ （無(wú)色）（棕黑色） ⑶結(jié)果：酶活性部位為棕黑色CoS沉淀。 4、顯示核酸的甲綠一派喏寧（Methyl green-pyronln）染色： ⑴原理：甲綠和派喏寧都是堿性染料，對(duì)兩種核酸（DNA和RNA）能分別染色，其機(jī)制可能在于兩種核酸分子都是多聚體，但聚合程度有所不同。甲綠具有兩個(gè)帶電荷的氨基，而派喏寧只有一個(gè)。因此在混合的染液中，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果是甲綠易與聚合程度較高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而派喏寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色。 （試劑制備及方法詳見(jiàn)組織學(xué)技術(shù)專著） ⑶結(jié)果：核內(nèi)DNA呈藍(lán)綠色，核仁及胞質(zhì)內(nèi)RNA呈桃紅色。 5、顯示糖原的過(guò)碘酸雪夫氏（PAS）反應(yīng)： ⑴原理：糖原是一種動(dòng)物多糖，無(wú)色，富含于肝細(xì)胞和肌細(xì)胞胞質(zhì)中。PAS反應(yīng)（Periodic acid schiff Reaction）能在糖原所在部位生成紫紅色物質(zhì)，從而將之顯示。RAS反應(yīng)分為兩步：首先是強(qiáng)氧化劑過(guò)碘酸（Periodic acid，分子式為HIO4），將糖原中的葡萄糖分子的C-C鍵打開(kāi)，將CHOH-CHOH氧化，生成二醛基，然后Schiff試劑中的無(wú)色亞硫酸品紅分子與糖的醛基結(jié)合，生成新的紫紅色復(fù)合物。 HIO4schiff試劑 多糖醛基紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物 （氧化） （試劑配制及方法詳見(jiàn)組織學(xué)技術(shù)專著） ⑵結(jié)果：糖原呈紫紅色顆粒狀。

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