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  小啦啦gg 2017-02-10 00:00:00

  基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常，從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷技術(shù)，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展。 　　常用基因診斷技術(shù)： 　　一、Southern印跡法（Southern blot） 　　基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強(qiáng)，當(dāng)電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。 　　當(dāng)含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標(biāo)記了的探針進(jìn)行雜交，并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進(jìn)行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補(bǔ)原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進(jìn)行放射自顯影。結(jié)合了同位素標(biāo)記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導(dǎo)致帶的缺失或位置改變。 　　二、聚合酶鏈反應(yīng) 　　近年來，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要?dú)w功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬至百萬倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進(jìn)一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴(kuò)增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。 　　三、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 　　小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析. 　　四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法 　　當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點(diǎn)突變時一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來. 　　PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。 　　五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法 　　單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism，SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。

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