按分離機制的不同，GX液相色譜法可以分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

這些方法在使用的過程中往往會遇到諸如鬼峰、基線漂移、拖尾、分叉峰、保留時間漂移、柱壓過高等系列問題，該如何解決這些問題呢？

01

用HPLC進行分析時，保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?

• 關(guān)于漂移問題

1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定

2、流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡

• 關(guān)于快速變化問題

1、流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定

2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出

3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進行適當混合

02

液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子

2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子

3、可能柱超載，減少進樣量

03

HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量

2、樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子

3、樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器

4、檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可

5、檢測器時間常數(shù)太大，解決辦法為降低時間參數(shù)

6、檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗

7、檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣

8、記錄儀測壓范圍不當。調(diào)整電壓范圍即可

9、流動相流量不合適。調(diào)整流速即可

10、檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線

04

做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?

1、泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理

2、比例閥失效，更換比例閥即可

3、泵密封墊損壞，更換密封墊即可

4、溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法

5、系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可

6、梯度洗脫，這時壓力波動是正常的

05

我Z近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么?

這是因為被分析物可能具有形成氫鍵的能力。

盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ods填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。

因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ods柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺(tea)，將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。

如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時間的重現(xiàn)。

06

我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么?

柱壓過高是HPLC柱用戶Z常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，可按下面步驟檢查問題的起因：

1、拆去保護預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查

2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查

3、將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子。此時，不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查。只適用于使用過的柱子

4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系

一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

07

色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理?

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下(不包括梯度)，峰型應(yīng)對稱而尖銳。

但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理的情況下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而難以對色譜峰作出合理的解釋，對于新手來說更是如此。

色譜雙峰指的是一種物質(zhì)，在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，表明含二種物質(zhì)。這種情況分為四種原因：

• 色譜柱

如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都出現(xiàn)雙峰(出峰越快，雙峰的可能性會減少)，尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出了問題——柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。

如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵。將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。

當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這時可以將進樣頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。

• 溶劑極性及進樣量

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。

目前，HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。Z佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。

當用溶劑極性強度大的試劑，如，純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如，定量管為20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比diyi峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，將進樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！?/p>

這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。

上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。

• 樣品的特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。

在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如，紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯。

• 參數(shù)

記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的。

例如，c-r3a數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2MS，HPLC為5MS，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎€峰或更多。

08

色譜柱中的流動相會排干嗎?

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。

如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了?色譜柱還能使用嗎?

事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。

同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。

可以嘗SY一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。

09

使用peek管路和接頭需要注意什么問題?

如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料制成的管路和接頭會非常方便。peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。

使用此類材料的管路需要注意的是：peek對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯跡象，但，peek遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管只能耐受近4000psi(但多數(shù)hplc應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會超過3000psi)。

使用peek接頭時則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的peek接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產(chǎn)生死體積或漏液。

10

液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響

• 等度保留

大多數(shù)色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。擁有溫控系統(tǒng)的實驗室一般都有全天候溫控設(shè)置，但這種設(shè)置可能引起室溫顯著變化，這對整夜運行的色譜系統(tǒng)就會有一些影響。

例如，我們實驗室的夜間溫度就設(shè)為4～7℃。在不同的季節(jié)，實驗室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峰離開“保留時間窗”，造成連續(xù)進樣中產(chǎn)生一系列的無效數(shù)據(jù)。

還有一個可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實驗室的位置。當色譜柱正對著空調(diào)的送風(fēng)口時，雖然整個實驗室的溫度非常穩(wěn)定，但色譜系統(tǒng)的溫度就會不斷的變化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。

• 梯度保留

溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。

我們發(fā)現(xiàn)柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，Z后，溫度的不平衡會導(dǎo)致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。

11

為何會基線漂移

1、柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)

2、流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)

3、流通池被污染或有氣體

4、檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線)

5、流動相配比不當或流速變化

6、柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時

7、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

8、樣品中有強保留的物質(zhì)(高k’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線

9、使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測器

10、檢測器沒有設(shè)定在Z大吸收波長處

• 解決方法

1、控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器

2、使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣

3、用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1n的硝酸。(不要用鹽酸)

4、取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗

5、更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速

6、用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱

7、檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑

8、改變分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子

9、重新設(shè)定基線。使用新的流動相

10、將波長調(diào)整至Z大吸收波長處。重選檢測波長

12

規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

1、在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)

2、漏液

3、流動相混合不完全

4、溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)

5、在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲)

6、泵振動

• 解決方法

1、流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。

2、檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

3、用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑

4、減少差異或加上熱交換器

5、斷開lc、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源。

6、在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器

13

不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

1、漏液

2、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成

3、流動相各溶劑不相溶

4、檢測器/記錄儀電子元件的問題

5、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

6、檢測器內(nèi)有氣泡

7、流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。

8、檢測器燈能量不足

9、色譜柱填料流失或阻塞

10、流動相混合不均勻或混合器工作不正常

• 解決方法

1、檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液

2、檢查流動相的組成

3、選擇互溶的流動相

4、斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正

5、用強極性溶液清洗系統(tǒng)

6、清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

7、用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

8、更換燈

9、更換色譜柱

10、維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置

在下期內(nèi)容中，我們將繼續(xù)對出現(xiàn)保留時間漂移、鬼峰、峰拖尾、倒峰等問題的原因以及實驗室常用脫氣方法、評價色譜柱的基本指標等內(nèi)容進行解析，敬請期待哦~

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*內(nèi)容來源 實驗室經(jīng)理人，侵刪

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