PCR 進(jìn)行的基本條件是什么??
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還有做PCR擴(kuò)增DNA片段實(shí)驗(yàn)的時候，延長變性時間對反應(yīng)有什么影響?~小弟沒分了，但很急要!由衷感謝各位前輩地回答!分以后補(bǔ)上.
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- 敏姐是個好人0 2017-05-26 17:11:34
- 1、 溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 1. 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的Z主要原因。DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鐘，但反應(yīng)管內(nèi)達(dá)到Tss還需一定時間，變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下93℃～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。變性所需的加熱溫度取決于模板及PCR產(chǎn)物雙鏈DNA中的G+C含量。雙鏈DNA中的G+C的比率越高，則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時間與DNA分子的長度相關(guān)，DNA分子越長，在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子完全分離所需的時間就越長。若變性溫度太低或變性時間太短，則只能使DNA模板中富含AT的區(qū)域產(chǎn)生變性，當(dāng)PCR循環(huán)中的反應(yīng)溫度降低時，部分變性的DNA模板又重新結(jié)合成雙鏈DNA，從而導(dǎo)致PCR的失敗。
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