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陰離子層析純化蛋白可以用含有edta的緩沖液嗎

dqbzzk1964 2017-09-16 11:05:50 455  瀏覽
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  • 天天聽音樂go 2017-09-17 00:00:00
    在蛋白質(zhì)純化中,除了離子交換層析之外,還有哪些常用的柱層析方法純化蛋白質(zhì) 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行分離純化的一種方法.蛋白質(zhì)的帶電性是由蛋白質(zhì)多肽中帶電氨基酸決定的.由于蛋白質(zhì)中氨基酸的電性又取決于介質(zhì)中的pH,所以蛋白質(zhì)的帶電性也就依賴于介質(zhì)的pH.當(dāng)pH較低時,負(fù)電基團(tuán)被中和,而正電基團(tuán)就很多; 在pH較高時,蛋白質(zhì)的電性與低pH時相反.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處的pH,使蛋白質(zhì)的正負(fù)電荷相等,此時的pH稱為等電點.離子交換層析所用的交換劑是經(jīng)酯化、氧化等化學(xué)反應(yīng)引入陽性或陰性離子基團(tuán)制成的,可與帶相反電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行交換吸附.帶有陽離子基團(tuán)的交換劑可置換吸附帶負(fù)電荷的物質(zhì),稱為陰離子交換劑,如DEAE-纖維素樹脂;反之稱為陽離子交換劑,如CM-纖維素樹脂.不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點,在一定的條件下解離后所帶的電荷種類和電荷量都不同,因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附.當(dāng)緩沖液中的離子基團(tuán)與結(jié)合在離子交換劑上的蛋白質(zhì)相競爭時,親和力小的蛋白質(zhì)分子首先被解吸附而洗脫,而親和力大的蛋白質(zhì)則后被解吸附和洗脫.因此,可通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度和/或改變酸堿度,便可改變蛋白質(zhì)的吸附狀況,使不同親和力的蛋白質(zhì)得以分離.

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細(xì)胞裂解緩沖液的主要成分——TRIS-HCL、EDTA

裂解是指細(xì)胞分裂或破裂的一種狀態(tài),裂解緩沖液是一種有助于打開細(xì)胞的溶液,它可以在一些實驗分析需要提取細(xì)胞內(nèi)容物時進(jìn)行使用,例如科學(xué)家在從細(xì)胞中提取DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行分析時就必須使用裂解緩沖液來輔助完成。細(xì)胞裂解緩沖液種類有很多,其中較常見的一種是TRIS—HCL緩沖液。

TRIS—HCL可以保持細(xì)胞裂解緩沖液的PH值zui佳狀態(tài),所以常用它作為裂解緩沖液的主要成分。裂解緩沖液有助于打開細(xì)胞,可以對細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行篩選,例如鹽、清潔劑、螯合劑和抑zhi劑,以及一些堿性化學(xué)品。它不僅可以區(qū)分篩選甚至還可以去除這些物質(zhì)。

裂解液除了生物緩沖劑之外,還包括一種螯合劑和抑zhi劑,例如乙二胺四乙酸(EDTA),因為這種化學(xué)物質(zhì)與帶有兩個正電荷的金屬離子(例如鎂和鈣)結(jié)合,可以使它們不能用于其他反應(yīng)。許多 DNA 酶(咀嚼 DNA 的蛋白質(zhì))和蛋白酶(將其他蛋白質(zhì)切碎的蛋白質(zhì))需要鎂離子才能發(fā)揮作用,因此通過剝奪這些關(guān)鍵成分,EDTA 有助于降低蛋白酶或 DNA 酶的活性水平。

德晟為專業(yè)生產(chǎn)生物緩沖劑和EDTA的廠家,現(xiàn)在生產(chǎn)的生物緩沖劑類產(chǎn)品有TRIS、TRIS-HCL、 HEPES、 TAPS 、MOPS、 CAPS、 BICINE、 EPPS、 PEP等一系列生物緩沖液,目前成立已有十多年,擁有十分豐富的研發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗與產(chǎn)品知識,可為客戶提供大量技術(shù)支持與售后保障。如有需要歡迎隨時聯(lián)系我們!


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酶聯(lián)免疫或化學(xué)發(fā)光免疫分析的對象包括有酶、蛋白、抗體、多肽、抗原、核酸、糖、脂質(zhì)等物質(zhì),其中酶、蛋白、抗體或多肽均屬于蛋白類分子,需要使用蛋白緩沖液來保護(hù)蛋白。

1. 生物緩沖液,包括有Tris-HCl緩沖液、Tricine緩沖液、PB磷酸緩沖液、CB碳酸緩沖液等,其中Tris的緩沖體系應(yīng)用較為普遍,緩沖能力比較強(qiáng),同時對蛋白有良好的溶解性,為蛋白提供合適的pH環(huán)境。

2. 鹽類,主要是氯化鈉,調(diào)節(jié)蛋白緩沖液的離子強(qiáng)度(類似鹽濃度)。通常配制時,需較少的離子強(qiáng)度防止蛋白沉淀;但需要將蛋白脫離出來時,應(yīng)增加離子強(qiáng)度,否則蛋白難以沉淀脫離完全。對于有些蛋白,兩性離子的鹽類有助于蛋白結(jié)合。

3. 表面活性劑:吐溫20、Triton X-100等,改變緩沖溶液表面張力,增加試劑相容性。

4. 有時還需要添加糖類如蔗糖、海藻糖等,惰性蛋白如Casein(酪蛋白),防腐劑如疊氮鈉、卡松(異噻唑啉酮混合物)等。

蛋白緩沖液選擇優(yōu)化

雖然蛋白緩沖液的基本組成類似,不過沒有通用的緩沖液,不同的系統(tǒng)必須分別優(yōu)化。不同的蛋白其合適的pH值、親水性、溶解性、穩(wěn)定性都有差異。另外,蛋白在緩沖液中越不穩(wěn)定,蛋白結(jié)合力越強(qiáng)。當(dāng)緩沖液pH與蛋白等電點相同時,蛋白最不穩(wěn)定,容易聚集沉淀。

蛋白緩沖液的穩(wěn)定作用

蛋白緩沖液中添加有糖,對包被蛋白的穩(wěn)定性有重要作用,減緩蛋白老化作用,并增加親水性;添加的表面活性劑也是增加蛋白的親水性,惰性蛋白也具有保護(hù)作用。在蛋白結(jié)合包被步驟中,需用沉淀劑(醇)降低蛋白的穩(wěn)定性,也可潤濕膜,減少膜帶有的靜電。

這里的蛋白在緩沖液中的穩(wěn)定與不穩(wěn)定是特定的,改變緩沖液的部分條件以優(yōu)化不同的蛋白處理步驟,前提都是不能使蛋白變性或失活。德晟是生物緩沖劑廠家,生產(chǎn)有Tris、Bicine、MOPS等多種緩沖劑。

 


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