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  曹操的眼神 2016-09-26 21:42:30

  　　離 心 技 術(shù) 　　離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻迷圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)。 　　1．用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備用的離心技術(shù)，轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。 　　2．用于生物、醫(yī)學、化學等實驗室分析研究的，轉(zhuǎn)速從每分鐘幾千到幾萬轉(zhuǎn)以上，此類技術(shù)的使用目的在于分離和純化樣品，以及對純化樣品的有關(guān)性能進行研究。 　　一、基本原理 　　1．離心力Centrifugal force (F) 　　F=mω2r 　　ω：旋轉(zhuǎn)角速度(弧度／秒) r:旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離(cm) 　　m：顆粒質(zhì)量 　　2．相對離心力 Relative centrifugal force (RCF) 　　RCF 就是實際離心力轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù) 　　RCF=F離心力／F重力 　　= mω2r/mg= ω2r/g 　　g為重力加速度(980．70g/sec2) 　　同為轉(zhuǎn)于旋轉(zhuǎn)一周等于2π弧度，因此轉(zhuǎn)子的角速度以每分鐘旋轉(zhuǎn)的次數(shù)(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)n或r/min)表示： 　　一般情況下，低速離心時常以r／min來表示，高速離心時則以g(或數(shù)字Xg)表示。 　　用“X g”表示每分鐘轉(zhuǎn)速可以真實反映顆粒在離心管不同位置的離心力。Dole&Cotzias制作了轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應的離心力列線圖(圖2—15)。 　　3．沉降系數(shù) Sedimentation coefficient (S) 　　當轉(zhuǎn)子內(nèi)樣品繞著旋轉(zhuǎn)軸離心時，樣品沉降率是由樣品顆粒的大小、形狀、密度和溶劑的粘度、密度以及離心加速度決定的，在一般情況下，樣品的沉降特征可以用沉降系數(shù)來表示： 　　S：是指單位離心場中粒子移動的速度。 　　S的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止狀態(tài)到達等速運動所經(jīng)過的時間。 　　S在實際應用時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒，1S二1×10-13秒。對一定的樣品，在一定的介質(zhì)中，樣品沉降系數(shù)S也常保持不變。文獻中常用沉降系數(shù)以描述某些生物大分子或亞細胞器大小。 　　二、離心設(shè)備 　　離心技術(shù)所使用的設(shè)備是由離心轉(zhuǎn)子、離心管及附件等組成。 　　(一)離心機 　　1. 低速離心機 　　一般Z高轉(zhuǎn)速在6000r/min以下。實驗室中常用于分離制備。 　　2．高速離心機 帶有能夠冷卻的離心腔制冷設(shè)備，這類離心機的速度控制比上述的低速離心機來得準確，工作時的實際速度和溫度可通過儀表顯示；配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子，可根據(jù)需要選用。此類離心機的Z高轉(zhuǎn)速在25000r／min以下，常用于生物大分子的分離制備。 　　3．超速離心機 由四個部分組成，即驅(qū)動和速度控制；溫度控制；真空系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)于。至今超迷離心機Z高轉(zhuǎn)速為85000-／min(可達600，000g左右)。常用于分離亞細胞器、病毒粒于、DNA、RNA和蛋白質(zhì)分于，在分離時無須加入可能引起被分離物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的物質(zhì)，故為觀察它們的“天然”結(jié)構(gòu)與功能提供了手段。 　　(二)轉(zhuǎn)子 　　主要有三種： 　　固定角式轉(zhuǎn)子(fixed—angle rotor)；水平轉(zhuǎn)子(swing—out rotor)；垂直轉(zhuǎn)子(vertical rotor)，還有帶狀轉(zhuǎn)子(zonal rotor)和連續(xù)轉(zhuǎn)于(continuous rotor)等。 　　1．固定角式轉(zhuǎn)子 離心管在離心機中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個固定的角度，角度變化在14—40°之間，常見的角度有20°、28°、34°及40°等。 　　因角式轉(zhuǎn)子的ZX低，轉(zhuǎn)速可較高，樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑；又因為有一定的角度，故在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀，這就是“管壁效應”，此效應使Z后在管底聚成的沉淀較緊密。 　　2．水平轉(zhuǎn)于 此類轉(zhuǎn)于靜止時，處在轉(zhuǎn)子中的離心管ZX線與旋轉(zhuǎn)軸平行，而在轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時，離心管ZX線由平行位置逐漸過渡到垂直位置，即與旋轉(zhuǎn)軸成90‘角，粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本一致，但也有少量的“管壁效應”。 　　由于此類轉(zhuǎn)予的ZX位置較高，樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑。它對于多種成分樣品分離特別有效，常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心。 　　3．垂直轉(zhuǎn)子 離心管垂直插入轉(zhuǎn)于孔內(nèi)，在離心過程中始終與旋轉(zhuǎn)軸子行，而離心時液層發(fā)生90°角的變化，從開始的水平方向改成垂直方向，轉(zhuǎn)子降速時，垂直分布的液層又逐漸趨向水平，待旋轉(zhuǎn)停止后，液面又完全恢復成水平方向。這是因為在進行密度梯度離心前，由于重力的作用，垂直轉(zhuǎn)予的粒子沉淀距離等于離心管的直徑，離心分離所徭的離心力Z小，適用于速率區(qū)帶離心和等密度離心，但一般不用于差速離心。 　　三、離心分離方法 　　根據(jù)離心原理，按照實際工作的需要，目前已有可設(shè)計出各種離心方法綜合起來大致可分三類 　　1. 平衡離心法 根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法(differential velocity centrifugation)和速率區(qū)帶離心法(rate zonal centrifugation)。 　　2．等密度離心法(isopynic centrifugation)又稱等比重離心法，根據(jù)粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。 　　3．經(jīng)典式沉降平衡離心法 用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化。 　　(一)差速離心法 　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。操作過程中一般是在離心后傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。 　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。 　　2．注意點： 　　①可用角式、水平式轉(zhuǎn)頭 　　②可用剎車 　?、垭y以獲得高純度 　　例：用差速離心法分離已破碎的細胞各組份 　　(二)速率區(qū)帶離心法 　　1．原理 　　速率區(qū)帶離心法是離心前在離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處的介質(zhì)密度Z小，離旋轉(zhuǎn)軸Z遠處介質(zhì)的密度Z大，但Z大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒于的Z小密度。這種方法是根據(jù)分離的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。 　　梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。 　　該離心法的離心時間要嚴格控制，即有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任意一個粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。 　　2．注意點： 　?、賴栏窨刂齐x心時間 　?、诹Ｗ用芏却笥诮橘|(zhì)密度 　　③樣品事先配制在較平緩的連續(xù)密度的梯度溶液 　?、懿荒苡媒鞘睫D(zhuǎn)頭、只能用水平式轉(zhuǎn)頭 　?、莶荒苡脛x車 　　(三)等密度離心法 　　1．原理 　　等密度離心法是在離心前預先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻粒子也發(fā)生重新分布。當管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在彎頂處粒子密度大于介質(zhì)密度時，則粒子沉降，Z后粒子進入到一個它本身的密度位置即粒子密度等于介質(zhì)密變，此時dr／dt為零粒子不再移動，粒子形成純組分的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。 　　2．注意點： 　　①離心時間要長 　?、诳捎媒鞘睫D(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭 　?、哿Ｗ用芏认嘟蛳嗟葧r不宜用 　?、苊芏忍荻热芤褐幸辛Ｗ用芏?　?、莶荒苡脛x車 　　四、梯度溶液的制備 　　(一)梯度材料的選擇原則： 　　1．與被分離的生物材料不發(fā)生反應，且易與所分離的生物材料分開。 　　2．可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。 　　3．不會對離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。 　　4．容易純化，價格便宜或容易回收。 　　5．濃度便于測定，如具有折光率。 　　6．對于分析超迷離心工作來說，它的物理性質(zhì)，熱力學性質(zhì)應該是己知的。 　　(二)梯度材料的應用范圍 下面簡單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質(zhì)及其應用范圍。 　　1．蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其Z高密度可達1．33g/ml，且由于價格低，容易制備，是現(xiàn)在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。 　　2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相對分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。 　　3．氯化銫：是一種離于性介質(zhì)、水溶性大，Z高密度可達1．91g／nd。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。 　　4．鹵化鹽類：KBr和NaCI可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。 　　5．Percoll: 是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP)，滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的。其粘度高，在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。 　　五、分析性超速離心 　　與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。 　　分析性超速離心的工作原理： 　　分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉(zhuǎn)子，一套真空系統(tǒng)和一套光學系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個柔性的軸聯(lián)接一個高速的驅(qū)動裝置，這軸可使轉(zhuǎn)于在旋轉(zhuǎn)時形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個小室：分析室和配衡室有上下二個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質(zhì)和DNA)或折射率的不同對沉降物進行監(jiān)視，后一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液時，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生一“峰”。由于沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標。

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