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  Snoworlove 2017-03-31 00:00:00

  2.1 概述 ? 在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的ZX課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無(wú)從談起.然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作. ? 與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： ? ⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物. ? ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長(zhǎng). ? ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備Z困難之處. ? ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷. ? 生物大分子的制備通?？砂匆韵虏襟E進(jìn)行： ? ①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì). ? ②建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵. ? ③通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì). ? ④生物材料的破碎和預(yù)處理. ? ⑤分離純化方案的選擇和探索，這是Z困難的過程. ? ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰. ? ⑦產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存. ? ? 分析測(cè)定的方法主要有兩類： ? 即生物學(xué)和物理、化學(xué)的測(cè)定方法. ? 生物學(xué)的測(cè)定法主要有：酶的各種測(cè)活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測(cè)定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等； ? 物理、化學(xué)方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等. ? 實(shí)際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測(cè)定更加快速、簡(jiǎn)便. 要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有： ? ①在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性. ? ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性. ? ③固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性. ? ④各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù). ? ⑤其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性. ? ⑥對(duì)其他生物分子的特殊親和力. ? 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等. ? 各種方法的基本原理可以歸納為兩個(gè)方面： ? ①利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等； ? ②將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場(chǎng)的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的，如電泳、離心、超濾等. ? 目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心. ? 2.2 生物大分子制備的前處理 ? 2.2.1 生物材料的選擇 ? 制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?材料的來(lái)源無(wú)非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物. ? 選擇的材料應(yīng)含量高、來(lái)源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理. ? 動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛。绻蟮某煞衷诩?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞. ? 植物要先去殼、除脂. ? 微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開. ? 生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存.動(dòng)物材料則需深度冷凍保存. ? 2.2.2 細(xì)胞的破碎 ? 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法. ? (1)機(jī)械法： ? 1) 研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿. ? 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎. ? (2)物理法： ? 1) 反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度而引起細(xì)胞溶脹破碎. ? 2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器.破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些. ? 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法.在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎. ? 4) 冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法.在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎. ? (3)化學(xué)與生物化學(xué)方法： ? 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái). ? 2) 溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物. ? 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解. ? 4) 有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用. ? ? 2.2.3 生物大分子的提取 ? “提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程. ? 影響提取的因素主要有： ? 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； ? 由固相擴(kuò)散到液相的難易； ? 溶劑的pH值和提取時(shí)間等. ? 通常： ? 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； ? 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； ? 溫度升高，溶解度加大； ? 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加. ? 提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性. ? ⑴ 水溶液提?。?? 蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主.稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶Z常用的溶劑.用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響因素是： ? 1) 鹽濃度（即離子強(qiáng)度）： ? 離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度下溶解度增加. ? 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象.鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果. ? 為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性.向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性. ? ? 2) pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān).過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè). ? 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在0℃～5℃的低溫操作. ? 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入YZ劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用. ? 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活.因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失.在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化. ? ⑵ 有機(jī)溶劑提取 ? 一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取. ? 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性. ? 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐模⒓嬗谐ルs質(zhì)提高純化效果的作用. 例如，胰島素（見講義p36）. ? 2.3 生物大分子的分離純化 ? 由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬(wàn)種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個(gè)適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本手段是相同的. ? 為了避免盲目性，節(jié)省實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考和借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，少走彎路.常用的分離純化方法和技術(shù)有： ? 沉淀法（包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等.本章以介紹沉淀法為主. ? 2.3.1 沉淀法 ? 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程.沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)Z常用的方法.通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離. ? 其基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變. ? 在生物大分子制備中Z常用的幾種沉淀方法是： ? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化. ? ⑵有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化. ? ⑶選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白. ? ⑷等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用. ? ⑸有機(jī)聚合物沉淀： 是發(fā)展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉淀劑. ? 2.3.1.1 中性鹽沉淀（鹽析法） ? 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”.除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離. ? 鹽析法應(yīng)用Z廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是： ? ①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備. ? ②操作簡(jiǎn)單、安全. ? ③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用. ? ⑴ 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理 ? 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大.親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個(gè)：即電荷和水膜.因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀.鹽析示意圖如下頁(yè)“圖 4”所示. ? ⑵ 中性鹽的選擇 ? 常用的中性鹽中Z重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)： ? 1) 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的.由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行.由下表可以看到， 硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類： ? 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 ? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 ? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? ? ? ? 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨 鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純 度提高了四倍. ? 3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 作用.有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的 （NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久. ? 4) 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境. ? ⑶ 鹽析的操作方法 ? Z常用的是固體硫酸銨加入法.將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀.鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾. ? 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法. ? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出. ? ⑷ 鹽析曲線的制作 ? 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度.具體操作方法如下(講義p39)： 蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽 和度％ ? ⑸鹽析的影響因素 ? 1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用.低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低.較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25 mg/mL～30mg/mL. ? 2) pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近. ? 3) 溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小.在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的.一般情況下，可在室溫下進(jìn)行.但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失. ? ? 2.3.1.2 有機(jī)溶劑沉淀法 ? ⑴基本原理 ? 有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一.其原理主要是： ? ①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀. ? ②由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用. ? ? 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是： ? ①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀. ? ②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）.因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用. ? 其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行. ? ⑵有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算 ? 用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶.沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮. ? 為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來(lái)進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀. ? ⑶有機(jī)溶劑沉淀的影響因素 ? 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃. ? 一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高. ? 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀.高濃度樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大. ? 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜. ? ? 3) pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力. ? 4) 離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì). ? 沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性. ? 2.3.1.3 選擇性變性沉淀法 ? 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純. ? ⑴ 熱變性 ? 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中. ? ⑵ 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性 ? 使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀.通常在冰浴或冷室中進(jìn)行. ? ⑶ 選擇性酸堿變性 ? 利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀.通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟. ? 2.3.1.4 等電點(diǎn)沉淀法 ? 利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度Z低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法.氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離. ? 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果. ? 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物. ? 2.3.1.5 有機(jī)聚合物沉淀法 ? 有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，Z早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒.近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化.其中應(yīng)用Z多的是 “聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫為 PEG )，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG. ? 本方法的優(yōu)點(diǎn)是： ? ①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性. ? ②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相當(dāng)多 的生物大分子. ? ③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除. ? 2.3.2 透析 ? 自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年.透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室Z簡(jiǎn)便Z常用的分離純化技術(shù)之一.在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù). ? 透析只需要使用專用的半透膜即可完成.保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”.截留分子量MwCO通常為1萬(wàn)左右. ? 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等. ? 2.3.3 超濾 ? 超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來(lái)發(fā)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù).超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化. ? 超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化. ? 超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種. ? 微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為500?！?4微米（1微米＝104埃），用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等. ? 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用于分離大分子溶質(zhì). ? 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑Z小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等. ? 超濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶. ? 在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等. ? 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑.對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到10～50％的濃度. ? 超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜. ? 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成.近年來(lái)發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等.這種膜在pH 1～14都是穩(wěn)定的，且能在90℃下正常工作.超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，能連續(xù)用1～2年. ? 超濾膜的基本性能指標(biāo)：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化學(xué)物理穩(wěn)定性（包括機(jī)械強(qiáng)度）等. ? 超濾裝置由若干超濾組件構(gòu)成.分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型. ? 由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等.這些物質(zhì)極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重的濃差極化和堵塞，這是超濾法Z關(guān)鍵的問題，要克服濃差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌. ? 2.3.4 冰凍干燥 ? 冰凍干燥機(jī)是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的儀器之一，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物大分子分離純化后的Z終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，Z好的辦法就是冰凍干燥

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