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  盧英財 2006-11-08 00:00:00

  光學(xué)顯微鏡的組成結(jié)構(gòu) 光學(xué)顯微鏡包括光學(xué)系統(tǒng)和機械裝置兩大部分，而數(shù)碼顯微鏡還包括數(shù)碼攝像系統(tǒng)，現(xiàn)分述如下： （一）機械裝置 1．機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。 2．目鏡筒位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定，目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈?zhǔn)胶推揭剖健? 3．物鏡轉(zhuǎn)換器它是一個旋轉(zhuǎn)圓盤，上有3～5個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。 4．載物臺是放置玻片的平臺，其ZY具有通光孔。臺上有一個彈性的標(biāo)本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。 5．調(diào)焦機構(gòu)利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動調(diào)焦機構(gòu)，使載物臺作粗調(diào)和微調(diào)的升降運動，從而使被觀察物體對焦清晰成像。 6．聚光器調(diào)節(jié)機構(gòu)聚光器安裝在其上，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強弱。 （二）光學(xué)系統(tǒng) 1．目鏡它是插在目鏡筒頂部的鏡頭，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小，目鏡可分為視場較小的普通目鏡，和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。較顯微鏡的目鏡上還裝有視度調(diào)節(jié)機構(gòu)，操作者可以方便快捷地對左右眼分別進行視度調(diào)整；此外，在這些目鏡上可以加裝測量分劃板，測量分劃板的象總能清晰地調(diào)焦在標(biāo)本的焦面上；并且，為了防止目鏡被取走以及減少運輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。 2．物鏡它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體（如杉木油），它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。 3．光源有鹵素?zé)簟㈡u絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。 4．聚光器包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強度。 （三）數(shù)碼攝像系統(tǒng) 1．?dāng)z像頭 2．圖像采集卡 3．軟件 4．微機 五、光學(xué)顯微鏡的分類 光學(xué)顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。 1．雙目體視顯微鏡 雙目體視顯微鏡又稱"實體顯微鏡"或"解剖鏡"，是一種具有正象立體感地目視儀器。在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點： （1）利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角--體視角（一般為12度--15度），為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質(zhì)上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。 （2）象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉(zhuǎn)過來的緣故。 （3）雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長。 （4）焦深大，便于觀察被檢物體的全層。 （5）視場直徑大。 目前體視鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)是：由一個共用的初級物鏡，對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開，并成一體視角再經(jīng)各自的目鏡成象，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的，因此又稱為"連續(xù)變倍體視顯微鏡"（Zoom-stereomicroscope）。隨著應(yīng)用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，照相，攝象，冷光源等等。 2．金相顯微鏡 金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。 3．偏光顯微鏡（Polarizingmicroscope） 偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。 （1）偏光顯微鏡的特點 將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。 （2）偏光顯微鏡的基本原理 偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過多介紹，偏光顯微鏡必須具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補償器或相位片，專用無應(yīng)力物鏡，旋轉(zhuǎn)載物臺。 （3）偏光鏡檢術(shù)的方式 a.正相鏡檢（Orthscope）:又稱無畸變鏡檢，其特點是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（BertrandLens），被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。 b.錐光鏡檢（Conoscope）：又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時產(chǎn)生的干涉圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強會聚偏振光束照明。 （4）偏光顯微鏡在裝置上的要求 a.光源：Z好采用單色光，因為光的速度，折射率，和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。 b.目鏡：要帶有十字線的目鏡。 c.聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。 d.伯特蘭透鏡：聚光鏡光路中的輔助部件，這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。 （5）偏光鏡檢術(shù)的要求 a.載物臺的ZX與光軸同軸。 b.起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。 c.制片不宜過薄。 4．熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。 （1）熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。 a.透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。 b.落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現(xiàn)整個視場的均勻照明。 （2）熒光鏡檢術(shù)的注意事項 a.激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。 b.作油鏡觀察時，應(yīng)用"無熒光油"。 c.熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進行。 d.電源Z好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。 目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。 5．相襯顯微鏡（Phasecontrastmicroscope） 在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標(biāo)本。 相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡中。 相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求： a.環(huán)狀光闌（Ringslit）:裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。 b.相板（Phaseplate）:裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，?quot;補償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。 相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個方面： a.光源要強，全部開啟孔徑光闌； b.使用濾色片，使光波近于單色。 6．微分干涉對比顯微鏡（DifferentialinterferencecontrastDIC） 微分干涉對比鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達到的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。 （1）原理 微分干涉對比鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。 （2）微分干涉對比鏡檢術(shù)所需的特殊部件： a.起偏鏡 b.檢偏鏡 c.渥拉斯頓棱鏡2塊 （3）微分干涉對比鏡檢時的注意事項 a.因微分干涉靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。 b.具有雙折射性的物質(zhì)，不能達到微分干涉對比鏡檢的效果。 c.倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉時，不能用塑料培養(yǎng)皿。 7．倒置顯微鏡（Invertedmicroscope） 倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護、食品檢驗等顯微觀察。 由于上述樣品特點的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿（或培養(yǎng)瓶）中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為"倒置顯微鏡"。 由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的Z大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X相差物鏡，因為倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要，也可以選配其它附件，用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。 目見倒置顯微鏡廣泛應(yīng)用于patch-clamp，transgeneICSI等領(lǐng)域。 8．?dāng)?shù)碼顯微鏡 數(shù)碼顯微鏡是以攝像頭（即電視攝像靶或電荷耦合器）作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入攝像頭取代人眼作為接收器，通過這種光電器件把光學(xué)圖像轉(zhuǎn)換成電信號的圖像，然后對之進行尺寸檢測、顆粒計數(shù)等工作。這類顯微鏡可以與計算機聯(lián)用，這便于實現(xiàn)檢測和信息處理的自動化，多應(yīng)用于需要進行大量繁瑣檢測工作的場合。 六、光學(xué)顯微鏡的使用規(guī)程 （一）實驗時要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿6～7cm左右。 （二）打開光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強到合適大小。 （三）轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。先把鏡頭調(diào)節(jié)至距載物臺1～2cm左右處，然后用左眼注視目鏡內(nèi)，接著調(diào)節(jié)聚光器的高度，把孔徑光闌調(diào)至Z大，使光線通過聚光器入射到鏡筒內(nèi)，這時視野內(nèi)呈明亮的狀態(tài)。 （四）將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正ZY，然后用標(biāo)本夾夾好載玻片。 （五）先用低倍鏡觀察（物鏡10X、目鏡10x）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，以防鏡頭將玻片壓碎。然后，左眼注視目鏡內(nèi)，同時右眼不要閉合（要養(yǎng)成睜開雙眼用顯微鏡進行觀察的習(xí)慣，以便在觀察的同時能用右眼看著繪圖），并轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。 （六）如果在視野內(nèi)看到的物像不符合實驗要求（物像偏離視野），可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄。調(diào)節(jié)時應(yīng)注意玻片移動的方向與視野中看到的物像移動的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以調(diào)節(jié)微動調(diào)焦手輪，直至物像清晰為止。 （七）如果進一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，把物像中需要放大觀察的部分移至視野ZY（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時，視野中的物像范圍縮小了很多）。一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動微動調(diào)焦手輪進行調(diào)節(jié)。 （八）在轉(zhuǎn)換高倍物鏡并且看清物像之后，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強弱）。 （九）觀察完畢，應(yīng)先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，然后將孔徑光闌調(diào)至Z大，再將載物臺緩緩落下，并檢查零件有無損傷（特別要注意檢查物鏡是否沾水沾油，如沾了水或油要用鏡頭紙擦凈），檢查處理完畢后即可裝箱。 七、光學(xué)顯微鏡的維護 （一）必須熟練掌握并嚴(yán)格執(zhí)行使用規(guī)程。 （二）取送顯微鏡時一定要一手握住彎臂，另一手托住底座。顯微鏡不能傾斜，以免目鏡從鏡筒上端滑出。取送顯微鏡時要輕拿輕放。 （三）觀察時，不能隨便移動顯微鏡的位置。 （四）凡是顯微鏡的光學(xué)部分，只能用特殊的擦鏡頭紙擦拭，不能亂用他物擦拭，更不能用手指觸摸透鏡，以免汗液玷污透鏡。 （五）保持顯微鏡的干燥、清潔，避免灰塵、水及化學(xué)試劑的玷污。 （六）轉(zhuǎn)換物鏡鏡頭時，不要搬動物鏡鏡頭，只能轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器。 （七）切勿隨意轉(zhuǎn)動調(diào)焦手輪。使用微動調(diào)焦旋鈕時，用力要輕，轉(zhuǎn)動要慢，轉(zhuǎn)不動時不要硬轉(zhuǎn)。 （八）不得任意拆卸顯微鏡上的零件，嚴(yán)禁隨意拆卸物鏡鏡頭，以免損傷轉(zhuǎn)換器螺口，或螺口松動后使低高倍物鏡轉(zhuǎn)換時不齊焦。 （九）使用高倍物鏡時，勿用粗動調(diào)焦手輪調(diào)節(jié)焦距，以免移動距離過大，損傷物鏡和玻片。 （十）用畢送還前，必須檢查物鏡鏡頭上是否沾有水或試劑，如有則要擦拭干凈，并且要把載物臺擦拭干凈，然后將顯微鏡放人箱內(nèi)，并注意鎖箱。 電子顯微鏡按成象原理不同有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡兩類。 透射電鏡成象原理與透射式光學(xué)顯微鏡完全相同，只不過是將可見光照明換成電子束照明，將玻璃透鏡換成電磁透鏡，將成象的毛玻璃換成熒光屏。由于成象透鏡總是對通過它的光波有衍射效應(yīng)（相當(dāng)于小孔衍射），衍射效應(yīng)會使象變得模糊，影響透鏡的分辨率?？梢杂嬎阏彰髟吹牟ㄩL越短，衍射效應(yīng)的影響越小。電鏡中使用的電子波的波長只是可見光的十萬分之一，這樣電鏡的分辨率大大提高了。 掃描電鏡成象就完全不同了，它是利用細聚焦高能電子束在樣品表面掃描激發(fā)出各種物理信號，如二次電子、背反射電子等。通過相應(yīng)的檢測器來檢測這些信號，再將其轉(zhuǎn)換為視頻信號來調(diào)制顯像管的亮度。由于信號的強度與樣品表面的形貌、成分有對應(yīng)關(guān)系，那么逐點在樣品上掃描一個面積，在顯像管上就相應(yīng)獲得該面積樣品表面的形貌或成分的一副圖象。掃描的面積越小，放大倍數(shù)就越高。

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