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  ding_tang 2009-03-17 00:00:00

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  nijiuzaiwo 2009-04-02 00:00:00

  美國(guó)藥典24版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 本文是USP24細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的譯文，但目前執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)是USP24版第二增補(bǔ)本（USP—NF19 Second Supplement）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，讀者可對(duì)照學(xué)習(xí)，從中可看出USP24細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的不足之處。本文將介紹用鱟試劑檢測(cè)樣品內(nèi)或樣品上存在的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的方法。鱟試劑（Limulus Amebocyte，LAL）來(lái)自鱟的循環(huán)細(xì)胞，經(jīng)水提取而行，制備和檢驗(yàn)后，用于凝固法。 反應(yīng)的終點(diǎn)是將供檢樣品稀釋后，與平行稀釋的參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行直接比較得到的。測(cè)得的內(nèi)毒素含量用規(guī)定的內(nèi)毒素單位表示。 鱟試劑也是用濁度法或顯色法來(lái)讀取數(shù)據(jù)的，這些試齊只要能滿(mǎn)足這些選擇方法的要求，就可以使用。在做試驗(yàn)時(shí)，需要先做出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并用該曲線(xiàn)計(jì)算供檢樣品的內(nèi)毒素含量，包括樣品和對(duì)照液加鱟試劑后的培育時(shí)間和在分光光度計(jì)上讀取光密度時(shí)使用的波長(zhǎng)等操作，都應(yīng)該事先規(guī)定好。如果是終點(diǎn)濁度法，則到達(dá)培育期后，應(yīng)立刻讀取讀數(shù)。而動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（兇手濁度法和顯色法），光密度的測(cè)定是貫穿于整個(gè)反應(yīng)期間，而用于計(jì)算結(jié)果的百分?jǐn)?shù)就是從這些讀數(shù)中計(jì)算出來(lái)的。在用終點(diǎn)法的顯色法檢測(cè)時(shí)，在到達(dá)事先規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間后，添加停止酶反應(yīng)的試劑使反應(yīng)停止后，再讀取數(shù)據(jù)。 1、參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)與對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（Reference standard endotoxin，RSE）是美國(guó)藥典（USP）的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)，其效價(jià)為每瓶10 000個(gè)USP內(nèi)毒素單位（EU）。每瓶參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)加5ml鱟試劑用水（LAL Reagent Watet），用旋轉(zhuǎn)攪拌器間歇攪拌30min使其溶解，制成原液，用這一原液制作合適的系列稀釋。原液應(yīng)保存于冰箱中，用于以后的稀釋?zhuān)４鏁r(shí)間不得超過(guò)14d。用前，用旋轉(zhuǎn)攪拌器QL攪拌至少3min，每一步稀釋?zhuān)辽贁嚢?0s，然后才能用它稀釋下一步。經(jīng)稀釋的參考內(nèi)毒素不得貯存待以后使用，因?yàn)槲阶饔脮?huì)使其失去活性。對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（Contuol standard endotoxin，CSE）是以參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)另行制備的。一批新的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)在使用前應(yīng)進(jìn)行檢定。檢定時(shí)使用的鱟試劑應(yīng)為試驗(yàn)中使用的同批鱟試劑。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定時(shí)，可使用鱟試劑的凝固法，按“試驗(yàn)操作”進(jìn)行。每批對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)，至少取1瓶與1瓶參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)稀釋度作4管。每瓶或每個(gè)樣品的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)稀釋度也都要4管。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)的對(duì)數(shù)Log10的平均值和對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)的對(duì)數(shù)Log10平均值之間的差值的反對(duì)數(shù)等于對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)的標(biāo)定值?？筛鶕?jù)情況，將其變換成每ng干燥制劑的單位數(shù)或每瓶所含的單位數(shù)。 適宜的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)應(yīng)不小于2EU/ng也不大于50EU/ng。 2、試驗(yàn)的準(zhǔn)備 鱟試劑的靈敏度應(yīng)經(jīng)過(guò)確證。試驗(yàn)中使用的所有容器和用具，都必須在≥250℃的烤箱中，用足夠的時(shí)間進(jìn)行加熱處理、破壞這些用具表面上可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素。 內(nèi)毒素試驗(yàn)的結(jié)果是否可靠，還必須從試驗(yàn)使用的各種用具、溶液、洗滌用品中取樣或提取樣品，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄗC明它們對(duì)反應(yīng)沒(méi)有YZ或拉強(qiáng)或其它干擾作用。可按下述方法進(jìn)行YZ試驗(yàn)或增強(qiáng)試驗(yàn)。試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。如果鱟試劑的原材料、生產(chǎn)方法或發(fā)生改變時(shí)都要重新進(jìn)行試驗(yàn)。 3、鱟試劑靈敏度的確認(rèn)試驗(yàn) 為了確認(rèn)鱟試劑標(biāo)簽上的靈敏度，每批至少取1瓶樣品進(jìn)行檢定。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（或?qū)φ諆?nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)）作2倍系列稀釋?zhuān)♂尦?.0λ，1.0λ，0.5λ和0.25λ。其中λ是鱟試劑標(biāo)簽上的靈敏度EU/ml。 上述4個(gè)稀釋度和陰性對(duì)照都要重復(fù)做4管。所得結(jié)果的幾何平均值的對(duì)數(shù)應(yīng)大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ。每一批新的鱟試劑，使用前都必須作標(biāo)簽靈敏度的確認(rèn)試驗(yàn)。 4、YZ試驗(yàn)和增強(qiáng)試驗(yàn) 用不超過(guò)地大有效稀釋而檢測(cè)不出內(nèi)毒素的樣品，不加或內(nèi)毒素，使Z后濃度等于2.0λ，1.0λ，0.5λ和0.25λ。按照試驗(yàn)操作（Test Procedure）項(xiàng)的規(guī)定用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素進(jìn)行檢定。不加和加內(nèi)毒素的樣品管至少做4管。同時(shí)，用水稀釋上述相同濃度的內(nèi)毒素和陰性對(duì)照各兩管，做平行兩管試驗(yàn)。按照計(jì)算和判定項(xiàng)的方法，計(jì)算樣品終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的幾何平均值。 如果所得結(jié)果大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ，則該樣品適合作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。 用中和、滅活或除去干擾物質(zhì)方法或用不超過(guò)Z大有效稀釋度稀釋檢品后，可重做YZ試驗(yàn)和增強(qiáng)試驗(yàn)。如果用不超過(guò)Z大有效稀釋法，對(duì)已知加量的內(nèi)毒素可以克服YZ和增強(qiáng)作用。則樣品可以經(jīng)過(guò)稀釋后，再作內(nèi)毒素檢查。 如果在試驗(yàn)條件下，對(duì)未處理的樣品檢查出有內(nèi)源性?xún)?nèi)毒素。則該樣品不適合用于作YZ或拉強(qiáng)試驗(yàn)。不過(guò)，這種樣品可用超過(guò)濾法將存在的內(nèi)毒素去掉或做適當(dāng)稀釋、使之適合于作YZ或增強(qiáng)試驗(yàn)。稀釋未處理樣品（像開(kāi)瓶溶解或在使用前注射前稀釋那樣），稀釋到檢驗(yàn)不到內(nèi)毒素但不超過(guò)Z大有效稀釋倍數(shù)。再用這些已稀釋的樣品重作YZ試驗(yàn)或增強(qiáng)試驗(yàn)。 5、Z大有效稀釋度（MVD） Z大有效稀釋度是指在使用時(shí)將藥物溶解或稀釋成恰好用于注射或其它非經(jīng)口途徑使用的濃度。有時(shí)為了避免給藥量的體積（EU/ml）計(jì)算。用試劑標(biāo)簽上的靈敏度（EU/ml）λ除限定濃度，就可以得到MVD因子。如果某一試劑的限量濃度是按重量或按藥品的活性單位計(jì)算（EU/mg或EU/單位）。用限量乘藥品在溶液中的濃度，或按標(biāo)簽說(shuō)明稀釋成的濃度（mg/ml或單位/ml），再除的λ，就可以得到MVD因子是準(zhǔn)備試驗(yàn)而使試驗(yàn)有效的限定稀釋因子。 6、試驗(yàn)操作 在準(zhǔn)備和進(jìn)行試驗(yàn)的過(guò)程中，必須十分注意，避免使樣品受到大量的細(xì)菌污染。為了定量檢測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量，常用系列稀釋法稀釋樣品。用幾何稀釋法，使每上一步稀釋較下一步稀釋成為定比關(guān)系。試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照。 供試的每一個(gè)樣品的每一步系列稀釋?zhuān)辽僖鲋貜?fù)性2管。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的系列稀釋?xiě)?yīng)包括至少兩個(gè)重復(fù)管。每一個(gè)框架的試管中都必須有一組標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的系列稀釋管。只要每一個(gè)框架的環(huán)境條件是均一的，一個(gè)框架中可以由幾個(gè)試管架組成。 （1）準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素以及鱟試劑的形狀與裝量，各個(gè)廠家不盡相同。因此，溶解和稀釋必須按標(biāo)簽的說(shuō)明進(jìn)行。樣品和鱟試劑混合物的pH，除另有規(guī)定外，必須位于6.0—8.0之間。樣品的pH在試驗(yàn)前，可添加滅菌的無(wú)內(nèi)毒素污染的氫氧化鈉、鹽酸或適宜的緩沖液調(diào)整。 （2）操作：取若干10mm×75mm試管或單個(gè)的試驗(yàn)管。每管加適量的陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、樣品和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照。陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照由鱟試劑、洗液或提取液添加2.0λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素置中，準(zhǔn)確記錄試管的放置時(shí)間、于37℃±1℃，放置60min±2min，輕輕地取出觀察。形成結(jié)實(shí)的凝膠，翻轉(zhuǎn)180°，停留于原處不動(dòng)者為陽(yáng)性，記（+）號(hào)。不形成凝膠或形成的凝膠不結(jié)實(shí)，則判為陰性、記（-）號(hào)。拿取試管時(shí)，要輕拿輕放，避免不必要的碰撞，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照呈陰性或內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的濃度不落在鱟試劑標(biāo)簽靈敏度2倍稀釋的±1之間，或任何陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性，試驗(yàn)應(yīng)判為無(wú)效。然后計(jì)算樣品中的內(nèi)毒素含量。 7、計(jì)算和判定 （1）幾何平均值的計(jì)算：系列稀釋Z后的陽(yáng)性管為樣品或樣品加內(nèi)毒素管的終點(diǎn)。記錄每管的終點(diǎn)濃度E，換算成對(duì)數(shù)終點(diǎn)濃度e，用下列公式計(jì)算終點(diǎn)的幾何平均濃度： 終點(diǎn)的幾何平均濃度=log-1(∑e/f) 其中∑e為各稀釋度對(duì)數(shù)終點(diǎn)之和；f為各稀釋度的重復(fù)管安數(shù)。 （2）內(nèi)毒素含量計(jì)算：計(jì)算被檢樣品中或被檢樣品上的內(nèi)毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）時(shí)，首先計(jì)算出終點(diǎn)濃度E，再乘以稀釋因子λ（λ為鱟試劑標(biāo)簽注明的靈敏度）。被檢樣品的幾何平均濃度等于∑e/f的反對(duì)數(shù)，其中e等于終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)，f為被檢樣品該稀釋度的重復(fù)管數(shù)。 （3）結(jié)果判定：如果內(nèi)毒素含量小于該品種規(guī)定的含量界限，則該品種符合規(guī)定。

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