參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  sijie199396 2012-11-07 00:00:00

  分子雜交（molecularhybridization）確定單鏈核酸堿基序列的技術(shù)。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。 探針：標(biāo)記方法有多種，常用的為同位素標(biāo)記法和生物素標(biāo)記法。雜交方法又可分為液相雜交和固相雜交。 雜交技術(shù)：目前使用較多的是固相雜交法。此法是先將待測單鏈核酸樣品（如為雙鏈，則須先變性成為單鏈）結(jié)合到硝酸纖維素膜上，然后與溶液中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。通過與電泳法和放射自顯影法結(jié)合，獲得雜交圖譜，再進(jìn)行定性或定量分析。分子雜交方法廣泛用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)中作為核酸片段堿基序列的檢測與鑒定手段。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已用于某些病毒或細(xì)菌引起的感染性疾病的診斷。它也可用于基因工程。不同來源蛋白質(zhì)的亞基結(jié)合過程也可稱為雜交。 在液相分子雜交中，兩種來源的核酸分子都處于溶液中，可以自由運動，其中有一種常是用同位素標(biāo)記的。從復(fù)性動力學(xué)數(shù)據(jù)的分析可探知真核生物基因組結(jié)構(gòu)的大致情況，如各類重復(fù)順序的含量及分布情況等。在固相分子雜交中，一種核酸分子被固定在不溶性的介質(zhì)上，另一種核酸分子則處在溶液中，兩種介質(zhì)中的核酸分子可以自由接觸。常用的介質(zhì)有硝酸纖維素濾膜、羥基磷灰石柱、瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠等。早期用瓊脂作為固定介質(zhì)的分子雜交方法曾被用來測定從細(xì)菌到人多種生物的DNA的同源程度。 （1）固相雜交 　　將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，所以Z為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 （2）液相雜交 　　所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，一種研究Z早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。主要缺點是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應(yīng)用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。 編輯本段固相膜核酸分子雜交（1）菌落原位雜交 　　（Colonyinsituhybridization）　　 將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA，再烘干固定DNA于膜上，與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。 （2）斑點雜交 　　（Dotblotting） 　　該方法是將被檢標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進(jìn)行雜交。 （3）Southern印跡雜交 　　（Southernblotting） 　　是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值?；痉椒ㄊ菍NA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長用）上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 （4）Northern印跡雜交 　　（Northernblotting）　　 　　DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為westernblotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印，標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫是一種QL、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。 （5）組織原位雜交 　?。═issueinsituhybridization）　　 簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。 　　用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針，探針的長度通常以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。Z近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。

  贊(3)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論