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  刷QB55 2011-10-22 00:00:00

  基本的流程（主要是抗體染色） http://www.scbt.com/protocols/protocol_08.pdf 基本原理 clip.lf2.cuni.cz/files/board/minikurz.ppt www.abdserotec.com/uploads/Flow-Cytometry.pdf

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  農哥哥99 2016-09-29 19:55:37

  　　原理： 　　流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流ZY的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由于光學性質的改變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射ZX的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。 　　在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。 　　在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量Z有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。 　　熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。 　　減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統(tǒng)；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。 操作過程： ①打開電源，對系統(tǒng)進行預熱； ②打開氣體閾，調節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)； ③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)； ④利用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的 基礎上，0和90散射的熒光強度Z強，并要求變異系數為Z??； ⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選 擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程； ⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)； ⑦因為實驗數據已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關閉 氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理； ⑧將所需結果打印出來。

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