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文獻精讀第37期

阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease, AD）是一種最為常見的神經(jīng)退行性疾病，患者表現(xiàn)為進行性的記憶和認(rèn)知功能喪失。隨著全/球人口老齡化的日益加劇，AD患者數(shù)量不斷增加，但是到目前為止，臨床上仍然缺乏能夠有效治療AD的藥物或手段。越來越多的證據(jù)表明，AD具有代謝性疾病的多種特征。例如，AD患者伴有大腦糖代謝障礙，并且它的發(fā)生先于患者認(rèn)知功能障礙幾十年。然而，糖代謝異常在AD發(fā)病過程中的作用機制目前仍知之甚少。

2022年10月6日，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張杰教授團隊在Nature Metabolism雜志上發(fā)表題為“Microglial hexokinase 2 deficiency increases ATP generation through lipid metabolism leading toβ-amyloid clearance”的研究論文。文章證實，己糖激酶2（Hexokinase2, HK2）通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的能量代謝，在小膠質(zhì)細胞清除病理性的Aβ聚合物和斑塊沉積的過程中發(fā)揮了重要作用，提示HK2可能是AD治療的一個關(guān)鍵作用靶點。廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張杰教授為本論文的通訊作者，冷歷歌副教授為本論文的第/一作者及共同通訊作者。

在AD中，小膠質(zhì)細胞通過消耗三磷酸腺苷（ATP）來清除具有神經(jīng)毒性的Aβ蛋白低聚物和斑塊沉積，這個過程需要大量的ATP。己糖激酶（HK）是葡萄糖代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶，能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-Phosphate, G-6-P），促進ATP的產(chǎn)生。HK包含四種亞型（HK1-4），其中HK2是胰島素敏感組織（如心臟、骨骼肌、脂肪和大腦）中主要的亞型。然而，HK2對AD中小膠質(zhì)細胞功能的作用尚不清楚。

在該研究中，作者首先檢測了在哺乳動物大腦中存在的HK1-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)HK2在AD患者和AD小鼠模型（5xFAD小鼠）的小膠質(zhì)細胞中表達特異性增高。隨后，作者構(gòu)建了小膠質(zhì)細胞HK2特異性敲除的小鼠，并與5xFAD小鼠雜交（CcKO-5xFAD），以觀察小膠質(zhì)細胞中HK2缺失對AD的影響。小膠質(zhì)細胞中HK2缺失可以減少Aβ斑塊，并拯救5xFAD小鼠的認(rèn)知功能障礙。此外，作者進一步利用抑/制劑來抑/制HK2活性，包括氯尼達明和3-溴/丙/酮酸，其中，氯尼達明已用于臨床上多種腫瘤的治/療。通過抑/制HK2激酶活性，作者同樣觀察到5xFAD小鼠大腦中Aβ斑塊減少，以及小鼠的認(rèn)知缺陷減輕。

圖1.小膠質(zhì)細胞中HK2缺失能夠減少Aβ斑塊，并拯救5xFAD小鼠的認(rèn)知功能障礙

小膠質(zhì)細胞在斑塊周圍聚集被認(rèn)為是吞噬清除病理性Aβ斑塊沉積的一個關(guān)鍵過程。作者進一步的實驗表明，抑制或敲除HK2能夠促進小膠質(zhì)細胞的遷移和吞噬能力，這種遷移和吞噬的過程都需要消耗能量。令人驚訝的是，藥物抑制或基因缺失HK2會降低神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞中ATP的產(chǎn)生，但是可以顯著增加小膠質(zhì)細胞中ATP的形成。這可能與大腦小膠質(zhì)細胞獨特的代謝模式有關(guān)，抑制HK2信號導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞內(nèi)脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase, LPL）表達上調(diào)，從而觸發(fā)脂肪酸代謝，迅速提升胞內(nèi)的ATP水平。最后，作者發(fā)現(xiàn)，HK2的兩種下游代謝物G-6-P和果糖-6-磷酸（Fructose-6-Phosphate, F-6-P）通過磷酸戊糖途徑調(diào)節(jié)NADPH水平，能夠逆轉(zhuǎn)HK2缺乏引起的LPL的升高。

總之，該研究證明了HK2是AD發(fā)病過程中糖酵解改變和脂質(zhì)代謝之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在HK2抑制或缺乏時，小膠質(zhì)細胞中的ATP水平顯著升高，但神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞中并沒有。這一發(fā)現(xiàn)首次證實，葡萄糖的低代謝可以增加小膠質(zhì)細胞中ATP的生成。此外，抑制小膠質(zhì)細胞HK2可有效促進AD小鼠Aβ斑塊的吞噬，減輕認(rèn)知障礙。這些結(jié)果表明，以HK2為靶點的基因或藥物干預(yù)可能是AD治療的一種新策略。

論文原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s42255-022-00643-4

團隊PI簡介

張杰，教授、博導(dǎo)，國家杰出青年科學(xué)基金、國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才等獲得者。長期從事重大腦疾病比如老年癡呆（AD）、抑郁癥等的致病機理和藥物開發(fā)研究。至今以第一作者或通訊作者發(fā)表論文30余篇。近5年張杰教授以通訊作者在國際知名學(xué)術(shù)期刊（Nature Neuroscience, Neuron, Biological Psychiatry, Cell Reports, PNAS, JNS, JBC，Clinical Cancer Research等）發(fā)表多篇論文。熱忱歡迎優(yōu)秀博士后加盟，同時歡迎優(yōu)秀學(xué)子報考廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院張杰教授課題組研究生。聯(lián)系方式：jiezhang@xmu.edu.cn

文獻精讀第41期

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，患者會出現(xiàn)日漸加重的認(rèn)知障礙，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量。AD的病理特征主要包括存在于細胞外的淀粉樣蛋白-β(Amyloid-β, Aβ)斑塊，以及神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。小膠質(zhì)細胞是定植于神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞，它可以通過物理或化學(xué)的手段來感知局部微環(huán)境的動態(tài)變化，來清除微環(huán)境中的損傷因子，從而對神經(jīng)元起到保護作用。在AD中，小膠質(zhì)細胞能夠識別并吞噬病理性的Aβ聚合物和斑塊沉積，因此對AD的靶點尋找和疾病治療和具有重要價值。然而對于小膠質(zhì)細胞是如何來感知并識別Aβ斑塊的作用機制，目前的研究尚未完全闡明。

2022年11月10日，廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院莫瑋教授團隊在Neuron雜志上發(fā)表了題為“Microglial Piezo1 senses Aβ fibrils stiffness to restrict Alzheimer’s disease”的研究論文。該研究證實，小膠質(zhì)細胞對不溶性Aβ纖維硬度的感知依賴于機械力受體Piezo1。在AD小鼠模型中，Piezo1缺失導(dǎo)致小鼠的Aβ病理和神經(jīng)退行性病變的加劇。相反，通過藥理學(xué)手段來激活Piezo1能夠顯著改善AD相關(guān)病理變化。該研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細胞中的Piezo1可能是一個有前景的AD治療靶點。

鑒于Aβ斑塊的多種化學(xué)成分，之前的研究工作主要集中在小膠質(zhì)細胞如何通過化學(xué)信號來感知Aβ斑塊。最近的研究表明，小膠質(zhì)細胞能夠?qū)C械力的變化做出反應(yīng)，并優(yōu)先遷移到更堅硬的基質(zhì)上，而小膠質(zhì)細胞對Aβ斑塊硬度響應(yīng)的機械感知尚不清楚。Piezo家族是哺乳動物細胞中的機械敏感性陽離子通道蛋白。作為機械力受體，Piezo可通過感受細胞膜機械力的變化，包括剪切應(yīng)力、硬度和周期性壓力等，并將機械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號。

為了確定Aβ斑塊在物理特性上的改變，文章作者利用原子力顯微鏡對在體標(biāo)記的Aβ斑塊進行了檢測。結(jié)果表明，在鮮活腦片中，Aβ斑塊組織的硬度顯著高于非Aβ斑塊組織。作者進一步分析發(fā)現(xiàn)，相對其他機械通道蛋白，Piezo1在小膠質(zhì)細胞中的表達最高。并且在體外原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞中，小膠質(zhì)細胞中Piezo1的表達受到不溶性Aβ纖維硬度刺激而增高。最后，作者通過鈣成像和電生理實驗證實了小膠質(zhì)細胞對纖維化Aβ硬度的感知依賴于Piezo1。此外，作者通過對AD小鼠模型和臨床尸檢樣本進行了檢測，觀察到Aβ斑塊附近的小膠質(zhì)細胞中Piezo1的表達顯著上調(diào)。

圖1.5×FAD小鼠與AD患者腦組織中小膠質(zhì)細胞Piezo1的表達升高

為了進一步確定小膠質(zhì)細胞中的Piezo1在Aβ病理中的作用，作者對小膠質(zhì)細胞中的Piezo1進行了敲除。Piezo1缺失加重了5×FAD小鼠（AD小鼠模型）的Aβ斑塊負擔(dān)、突觸丟失以及認(rèn)知損害，而且還會損害小膠質(zhì)細胞的吞噬活性，減少小膠質(zhì)細胞向Aβ斑塊的聚集，導(dǎo)致斑塊被包裹的程度減少，斑塊更加松散。與之相反，在5×FAD小鼠中，作者在利用激動劑激活Piezo1后，小膠質(zhì)細胞在Aβ斑塊周圍的聚集以及對Aβ斑塊的吞噬顯著增加，并且小鼠的認(rèn)知功能也得到明顯改善。然而，當(dāng)小膠質(zhì)細胞中的Piezo1被敲除后，給予Piezo1激動劑不再具有改善Aβ相關(guān)病理的作用。這些結(jié)果表明，Piezo1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活對于抑/制Aβ相關(guān)病理以及認(rèn)知功能改善至關(guān)重要。

圖2.小膠質(zhì)細胞Piezo1激活能夠顯著改善5×FAD小鼠的Aβ斑塊負擔(dān)和認(rèn)知能力

綜上，小膠質(zhì)細胞可通過機械感覺離子通道Piezo1來感知Aβ纖維硬度，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞對Aβ斑塊的反應(yīng)，從而阻止Aβ病理的擴散，凸顯了小膠質(zhì)細胞機械生物學(xué)在AD病理中的保護作用。此外，激活小膠質(zhì)細胞中的Piezo1減輕了AD相關(guān)病理，進一步提高了調(diào)節(jié)Piezo1活性在AD治療中的價值。從機械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑揭示小膠質(zhì)細胞Piezo1在AD病理中的作用，將進一步拓展我們對AD發(fā)病機制的理解。

研究方法亮點

這項工作揭示了小膠質(zhì)細胞通過機械力受體Piezo1感知纖維化Aβ硬度的作用機制。研究用到了腦立體定位注射、膜片鉗記錄、原代細胞培養(yǎng)、免疫組化以及細胞分子檢測等實驗技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)。在該研究中，研究人員采用了瑞沃德公司生產(chǎn)的腦立體定位注射系統(tǒng)，為實驗的順利開展提供了支持。此外，瑞沃德還可提供的該研究所涉及的電生理記錄、原代細胞培養(yǎng)、免疫組化以及細胞分子檢測等實驗的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外100多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全/球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全/球科研人員發(fā)表SCI文章14500+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。

論文原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.10.021

今天要跟大家分享一篇關(guān)于M2型小膠質(zhì)細胞外小泡（M2 microglial small extracellular vesicles，M2-sEVs）以及膠質(zhì)瘢痕（glial scar）的研究。

先看圖：

▲電鏡下M2-sEVs.的形態(tài)

▲這是GFAP染色后，共聚焦顯微鏡下，不同處理措施（PBS、M2-sEV）下腦組織梗死區(qū)膠質(zhì)瘢痕（glial scar）的形態(tài)。C：梗死中心區(qū)域；GS：膠質(zhì)瘢痕區(qū)域；P：梗塞壞死灶周圍區(qū)域。

再說結(jié)果：

▲ 甲苯基紫染色呈現(xiàn)不同處理措施下，腦組織萎縮體積的變化情況

（Sham：假手術(shù)組；PBS：腦梗死后通過尾靜脈注射PBS；M2-sEV：腦梗死后通過尾靜脈注射M2型小膠質(zhì)細胞外小泡；miR-124-kd:通過基因敲除miR-124的腦梗死動物組）

▲ 組織梗死或存活比例情況及神經(jīng)行為評分情況（mNSS）

▲ 動物轉(zhuǎn)棒實驗及右轉(zhuǎn)實驗情況

經(jīng)過系列實驗得出結(jié)論，也是本文的標(biāo)題：《M2 microglial small extracellular vesicles reduce glial scar formation via the miR-124/STAT3 pathway after ischemic stroke in mice》即，M2小膠質(zhì)細胞外小泡通過miR-124/STAT3途徑減少小鼠缺血性卒中后膠質(zhì)瘢痕形成。

實驗研究方法，是通過阻斷ICR小鼠大腦中動脈后連續(xù)7天，每天通過尾靜脈注射M2小膠質(zhì)細胞外小泡，來檢測缺血后腦組織膠質(zhì)瘢痕、梗死體積、神經(jīng)功能評分情況的研究。

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值得注意的是，本篇文章是2021年1月1日發(fā)表在Theranostics，這是個對于交叉學(xué)科研究很友好的雜志，該雜志2021年影響因子高達11.556！這篇研究的成果來自于上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院的科研團隊。

如果你對本文的研究思路感興趣

如果你也在研究不同類型小膠質(zhì)細胞的功能

或?qū)游锸中g(shù)造模操作、miR-124/STAT3 pathway感興趣的話

下面有個好消息告訴你

10月28日，本科研成果團隊的作者之一，上海交通大學(xué)MED-X研究院科研副院長楊國源教授將做客瑞沃德大成學(xué)堂卒中基礎(chǔ)研究系列講座。

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文獻精讀第25期

文章概述

對人來說，皮膚溫度高于43℃會引起急性疼痛，長時間暴露于傷害性熱刺激中會造成組織損傷，并破壞體溫的動態(tài)平衡。脊髓背角神經(jīng)元在處理和傳遞來自背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion, DRG）痛覺傳入纖維的感覺信號中起著關(guān)鍵作用，但是，傷害性熱刺激信號在脊髓中的處理過程尚不清楚。2022年5月12日，美國凱斯西儲大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員在《Neuron》雜志上發(fā)表題為“A novel spinal neuron connection for heat sensation”的文章，該研究證實了由脊髓ErbB4+（ErbB4，一種表皮生長因子受體家族的酪氨酸激酶受體）神經(jīng)元能夠通過NRG1-ErbB4信號通路來調(diào)控機體對傷害性熱刺激的感受，揭示了脊髓中一個新的傷害性熱刺激感受的調(diào)控機制。

核心觀點

1、脊髓ErbB4+神經(jīng)元能夠被傷害性熱刺激所激活；

2、脊髓ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+傷害感受器的單突觸神經(jīng)支配；

3、消融或抑制ErbB4+神經(jīng)元會降低動物對傷害性熱刺激的感受；

4、同時抑制脊髓中ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元能夠進一步降低傷害性熱刺激的感受；

5、NRG1-ErbB4信號通路能夠促進傷害性熱刺激的感受和熱痛過敏反應(yīng)。

研究結(jié)果分析

1. 傷害性熱刺激能夠激活脊髓中ErbB4+興奮性神經(jīng)元

為了識別對傷害性熱刺激產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)元，作者利用了EGFP表達依賴于內(nèi)源性cFos啟動子的cFos::shEGFP小鼠。當(dāng)cFos::shEGFP小鼠受到傷害性熱刺激（52℃熱板）時，脊髓背角神經(jīng)元中的shEGFP表達增加，大量的shEGFP+神經(jīng)元位于脊髓背角表層（Ⅰ~Ⅱ?qū)樱@是傷害性感覺信息的接收區(qū)域。單細胞RT-PCR結(jié)果顯示，78%的shEGFP+神經(jīng)元為興奮性神經(jīng)元（Vglut2+），22%的shEGFP+神經(jīng)元為GABA能神經(jīng)元（GAD65/67+）。這與之前的研究結(jié)果一致，即大多數(shù)對傷害性熱刺激產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)元是興奮性神經(jīng)元。然而，shEGFP+神經(jīng)元具有極高的異質(zhì)性，涉及到多種類型的神經(jīng)元，比如，其中膽囊收縮素陽性（Cholecystokinin+, CCK+）和生長激素抑制素陽性（Somatostatin+, SST+）神經(jīng)元分別占18%和14%。值得注意的是，~1/3的shEGFP+神經(jīng)元表達了ErbB4，而ErbB4主要表達于興奮性神經(jīng)元中。

這些結(jié)果表明，傷害性熱刺激能夠激活一群ErbB4+興奮性神經(jīng)元。為了驗證這一假設(shè)，作者對ErbB4:: CreER;Ai9小鼠進行熱刺激，該小鼠tdTomato的表達依賴于內(nèi)源性的ErbB4啟動子。在脊髓中，ErbB4-tdT+神經(jīng)元主要集中在背角，分布于多層背角和脊髓外側(cè)核（Lateral Spinal Nucleus, LSN）中，然而，熱激活的ErbB4-tdT神經(jīng)元（cFos+）主要位于脊髓背角表層中。ErbB4-tdT神經(jīng)元約占cFos+神經(jīng)元33%。這些結(jié)果確認(rèn)了脊髓背角表層ErbB4+興奮性神經(jīng)元是一種新型的傷害性熱反應(yīng)細胞。

2. 脊髓ErbB4+，SST+和CCK+神經(jīng)元負責(zé)傷害性熱刺激感受

接下來，作者通過在ErbB4::CreER;LSL-EYFP（ErbB4-EYFP）小鼠椎管內(nèi)注射AAV-mCherry-DIO-dtA（AAV-dtA）病毒，在ErbB4+細胞中特異性的表達A型白喉毒素（diphtheria toxin subunit A, dtA）來消融脊髓中的ErbB4+神經(jīng)元。與注射對照病毒的小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠中EYFP+細胞和Nmur2+神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。接下來，小鼠接受了一系列的行為測試。與對照小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠在熱板以及哈格里夫斯實驗中，后爪退縮和舔爪的潛伏期中增加了~40%，表明ErbB4+神經(jīng)元對傷害性熱刺激的感受至關(guān)重要。辣椒素能夠激活感覺神經(jīng)元中的TRPV1受體，誘發(fā)自發(fā)性疼痛，與對照組相比，在AAV-dtA注射的ErbB4-EYFP小鼠，辣椒素誘導(dǎo)的小鼠舔足次數(shù)減少了30%。這些結(jié)果表明，ErbB4+神經(jīng)元是傷害性熱刺激的感受所必需的。此外，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠對機械刺激、冰冷-溫?zé)?、以及癢刺激的反應(yīng)與對照類似。這表明脊髓ErbB4+神經(jīng)元可能不參與這些刺激的感受。

除了ErbB4+神經(jīng)元，SST+和CCK+中間神經(jīng)元也會被傷害性熱刺激激活。為了確定它們對熱刺激感受的貢獻，作者分別消融了這些神經(jīng)元。在熱板以及哈格里夫斯實驗中，消融SST+神經(jīng)元后小鼠的反應(yīng)潛伏期分別增加了26%和22%，而消融CCK+神經(jīng)元的反應(yīng)潛伏期則沒有增加。值得注意的是，將ErbB4+、SST+和CCK+三類神經(jīng)元同時消融時，小鼠對傷害性熱刺激感受的抑制作用顯著增加到60% - 80%。這些結(jié)果表明，傷害性熱刺激感受涉及脊髓中的ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元。

3. ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+痛覺感受器的單突觸神經(jīng)支配，且能被傷害性熱刺激而非機械刺激所激活

不同的軀體感覺信息由不同類型的傳入纖維傳入脊髓背角：Aβ纖維主要用于傳遞非傷害性刺激，而Aδ和C纖維用于傳遞傷害性刺激。為了確定ErbB4+神經(jīng)元的信息來源，作者利用帶背根的縱向脊髓切片來記錄背角中ErbB4+神經(jīng)元的興奮性突觸后電流（EPSCs）。對于Aδ和C纖維的刺激傳入，分別有76%和54%的表層ErbB4+神經(jīng)元記錄到了EPSCs，其中67%和46%的ErbB4+神經(jīng)元為單突觸傳入。相比之下，表層中有25%的ErbB4+神經(jīng)元記錄到Aβ纖維信息傳入，只有9.1%是單突觸傳入。此外，在深層ErbB4+神經(jīng)元中，6.7%和5.6%的神經(jīng)元接受Aδ和C纖維的單突觸傳入。這些結(jié)果表明，淺表層的ErbB4+神經(jīng)元主要接受攜帶傷害性信息的C和Aδ纖維的單突觸傳入。

為了驗證ErbB4+神經(jīng)元是否被TRPV1+傷害性感受器的突觸支配，作者用到了QX-314（一種細胞內(nèi)鈉通道抑制劑，其細胞進入依賴于TRPV1的激活）。單獨使用QX-314對C纖維傳入的ErbB4+神經(jīng)元EPSC振幅影響不大。然而，在TRPV1激活物辣椒素存在的情況下，QX-314使EPSCs減弱，表明ErbB4+神經(jīng)元接受TRPV1+纖維的支配。與之一致的是，在QX-314和辣椒素的存在下，對C纖維刺激有反應(yīng)的ErbB4+神經(jīng)元的數(shù)量減少了。這種作用是C纖維特異性的，因為A纖維中TRPV1表達較低，QX-314對刺激A纖維產(chǎn)生的EPSCs的影響不大。這些結(jié)果為表層ErbB4+神經(jīng)元受TRPV1+ C纖維的支配提供了藥理學(xué)依據(jù)。為了找到這種神經(jīng)支配的形態(tài)學(xué)證據(jù)，作者將AAV-DIO-mCherry注射到TRPV1::Cre;ErbB4::CreER小鼠脊髓腰膨大區(qū)標(biāo)記ErbB4+神經(jīng)元，并將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到DRG中標(biāo)記TRPV1+末端。脊髓切片用突觸后標(biāo)記物Homer進行染色標(biāo)記?？梢钥吹紼rbB4+神經(jīng)元（mCherry+）被TRPV1+末端（即EYFP+）包圍。TRPV1+末端與Homer+突觸以及ErbB4+細胞密切相關(guān)。這些結(jié)果進一步表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元受到DRG中TRPV1+ 傳入纖維的支配。

為了證明這些突觸是有功能的，作者利用光遺傳學(xué)激活表達視蛋白ChR2的TRPV1+末端。42%的表層ErbB4+神經(jīng)元能夠在光刺激下誘發(fā)EPSCs，這些EPSCs被TTX所抑制，而在TTX和4-AP同時存在的情況下，仍有36%的ErbB4+表層神經(jīng)元能夠被光刺激誘發(fā)EPSCs，這表明它們是由DRG中TRPV1+傳入纖維的單突觸所支配的。綜上所述，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元直接受TRPV1+傷害性感受器的單突觸神經(jīng)支配。

為了確定ErbB4+神經(jīng)元是否對機械刺激產(chǎn)生反應(yīng)，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到MrgprD::CreER;ErbB4::CreER小鼠DRG中，讓傳導(dǎo)機械刺激的MrgprD+神經(jīng)元表達ChR2，同時將AAV-DIO-mCherry注射到腰膨大來標(biāo)記ErbB4+神經(jīng)元。然而，對脊髓切片進行光刺激，大多數(shù)的ErbB4+神經(jīng)元（87%）未能記錄到EPSCs，這表明大多數(shù)ErbB4+神經(jīng)元不接受來自機械刺激感覺神經(jīng)元的傳入。在3個響應(yīng)ErbB4+神經(jīng)元中，有2個被TTX和4-AP抑制，表明它們接受了多級突觸傳導(dǎo)，只有一個出現(xiàn)了4-AP增強的EPSCs，表明其受到機械感覺神經(jīng)元的單突觸支配。作為對照，作者采用了相同的策略來觀察SST+脊髓神經(jīng)元對機械感覺神經(jīng)元刺激的反應(yīng)。大多數(shù)記錄的SST+神經(jīng)元（72%）產(chǎn)生了光刺激誘導(dǎo)的EPSCs，表明它們接受MrgprD+機械感覺神經(jīng)元的傳入，且61%為單突觸支配。這些結(jié)果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元主要受傷害性熱刺激感受神經(jīng)元的支配，而非機械刺激感覺神經(jīng)元的支配。

為了進一步表征在更接近生理條件下ErbB4+神經(jīng)元的敏感性，作者構(gòu)建了半完整的離體檢測范式，通過分離相連的部分脊髓、腰椎根、DRG、隱神經(jīng)和后肢皮膚，來記錄脊髓ErbB4+神經(jīng)元對皮膚刺激的反應(yīng)。在記錄的16個ErbB4+神經(jīng)元中，有9個（56%）對52℃刺激有反應(yīng)，有5個（30%）對0℃刺激有反應(yīng)。對15℃和40℃刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元分別為1個（7%）和2個（13%）。這些結(jié)果表明，表層ErbB4+神經(jīng)元對傷害性熱刺激的反應(yīng)較好，其次是冰冷刺激，而對涼或溫?zé)岽碳さ姆磻?yīng)較弱。為了確定ErbB4+神經(jīng)元是否對機械刺激有反應(yīng)，研究者用Von-Frey絲刺激皮膚。在16個記錄的神經(jīng)元中，有14個無反應(yīng)。這些結(jié)果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經(jīng)元對傷害性熱刺激比機械刺激更敏感。

4.抑制ErbB4+神經(jīng)元會減弱動物對傷害性熱刺激的感受，反之則增強動物對熱刺激的感受

隨后，作者探討了脊髓ErbB4+神經(jīng)元活性對傷害性熱刺激感受的影響。為了降低ErbB4+神經(jīng)元的活性，作者將AAV-DIO-hM4Di-mCherry（AAV-hM4Di）注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大，并通過CNO來抑制ErbB4+神經(jīng)元活性。與對照相比，抑制ErbB4+神經(jīng)元增加了小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期，并減少了辣椒素誘導(dǎo)的舔足。抑制SST+而非CCK+神經(jīng)元，小鼠在熱板以及哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期增加，但對辣椒素誘導(dǎo)的舔足沒有影響。值得注意的是，當(dāng)這三類的神經(jīng)元活性同時降低時，小鼠對傷害性熱刺激感受的抑制效果增加60%~80%。這些結(jié)果表明脊髓ErbB4+、SST+和CCK+神經(jīng)元的活動共同參與傷害性熱刺激感受，支持群體編碼模式理論。

為了增加脊髓ErbB4+神經(jīng)元的活性，作者將AAV-DIO-hM3Dq-mCherry注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大。與對照相比，激活ErbB4+神經(jīng)元降低了小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期，且增加了辣椒素誘導(dǎo)的持續(xù)舔足時間。表明， ErbB4+神經(jīng)元激活增強了動物對傷害性熱刺激的感受。總之，這些結(jié)果揭示了ErbB4+神經(jīng)元在傷害性熱刺激感受中的關(guān)鍵作用。

5. 傷害性熱刺激的感受依賴ErbB4激酶的活性

ErbB4由生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin 1, NRG1）所激活，為了檢測NRG1-ErbB4信號通路是否參與了傷害性熱感受，作者檢測了脊髓背角NRG1和pErbB4的表達。結(jié)果顯示，暴露于52℃熱板的小鼠其脊髓背角NRG1和pErbB4的表達增加，表明傷害性熱刺激可以增強脊髓背角的NRG1-ErbB4信號。接下來，作者評估了 ErbB4的存在對傷害性熱刺激的感受是否必要，為此，作者構(gòu)建了ErbB4-rKO小鼠（該小鼠在除心臟外的任何組織，包括脊髓中都不表達ErbB4）。值得注意的是，與對照組小鼠相比，ErbB4-rKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期增加，且辣椒素誘導(dǎo)的舔足次數(shù)減少，表明ErbB4在這些反應(yīng)中發(fā)揮了作用。隨后，為了消除其它組織中ErbB4突變可能存在的影響，作者通過在ErbB4f/f小鼠脊髓腰膨大注射了AAV-Cre-GFP病毒，來特異性的敲除脊髓背角中的ErbB4。與對照組相比，脊髓背角ErbB4敲除使得小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期增加，辣椒素誘導(dǎo)的舔足次數(shù)減少。這些結(jié)果揭示了ErbB4在傷害性熱刺激感受中的必要作用。

為了確定熱感受是否涉及ErbB4的激酶活性激活，作者以鞘內(nèi)注射的方式給小鼠注射阿法替尼（一種ErbB激酶抑制劑）。阿法替尼顯著減少了脊髓腰膨大中pErbB4的表達。動物在熱板、哈格里夫斯和辣椒素實驗中的反應(yīng)也減弱，但對針刺、掐和Von-Frey絲刺激反應(yīng)的影響不大。這些結(jié)果提示ErbB4激酶活性與傷害性熱刺激感受有關(guān)。為了進一步驗證這一點，作者對敲入突變株的T796G小鼠進行了研究，在T796G小鼠中，ErbB4可以被體積較大的抑制劑1NMPP1特異性抑制。鞘內(nèi)注射1NMPP1可降低脊髓腰膨大中pErbB4的表達。在行為反應(yīng)測試中，1NMPP1顯示了類似阿法替尼的效果。總之，這些結(jié)果表明脊髓中ErbB4的激酶活性與傷害性熱刺激感受有關(guān)。

6. DRG中的NRG1參與了傷害性熱刺激的感受

為了確定傷害性熱刺激感受是否與內(nèi)源性NRG1有關(guān)，小鼠被注射了ecto-ErbB4（一種NRG1中和肽）。鞘內(nèi)注射ecto-ErbB4可減少脊髓中的pErbB4表達，并且增加小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期，減少辣椒素引起的舔足，但不會影響對針刺、掐和Von-Frey刺激的反應(yīng)。這些結(jié)果表明，內(nèi)源性NRG1參與了傷害性熱刺激的感受。

NRG1在DRG中大量表達，為了確定DRG神經(jīng)元中的NRG1是否參與熱感覺，作者構(gòu)建了advillin-CreER;NRG1f/f小鼠，通過給予他莫西芬，可以誘導(dǎo)小鼠感覺性神經(jīng)節(jié)中NRG1的條件性敲除（cKO）。與對照相比，cKO小鼠脊髓中的NRG1和pErbB4蛋白的表達均減少，NRG1 mRNA的水平在DRG中降低，但在脊髓中沒有顯著變化。cKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期增加，在辣椒素實驗中的舔足次數(shù)減少。然而，脊髓中的NRG1敲低對熱刺激行為反應(yīng)或背角中的pErbB4幾乎沒有影響。這些結(jié)果表明DRG中的NRG1信號在傷害性熱刺激的感受中起作用。

7. NRG1-ErbB4信號能夠調(diào)控ErbB4+神經(jīng)元谷氨酸的傳遞

上述結(jié)果已經(jīng)證明，表層中c-Fos+ ErbB4+神經(jīng)元大部分是興奮性神經(jīng)元。為了確定NRG1和ErbB4是否能夠調(diào)節(jié)谷氨酸的傳遞，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒注射到ErbB4::CreER;Ai9小鼠中，在ErbB4+神經(jīng)元中特異性表達ChR2。在脊髓切片中，通過光刺激激活這些表達ChR2的ErbB4+神經(jīng)元，并在其鄰近的ErbB4-神經(jīng)元中記錄突觸后電流（PSCs）。在記錄的112 個ErbB4-神經(jīng)元中，當(dāng)膜電位鉗制在-70 mV時，其中31個神經(jīng)元記錄到了光刺激誘發(fā)的內(nèi)向電流；當(dāng)膜電位為0 mV時，所有神經(jīng)元均未記錄到光刺激誘發(fā)的外向電流，表明這些電流是EPSCs，而不是IPSCs。這些結(jié)果表明，表層的ErbB4+神經(jīng)元通過谷氨酸傳遞與下游神經(jīng)元進行交流。事實上，這些EPSCs能夠被AMPA受體和NMDA受體抑制劑CNQX和AP-5阻斷。根據(jù)這些EPSCs對TTX和4-AP的潛伏期和阻抗，可以確定，半數(shù)下游神經(jīng)元接受ErbB4+神經(jīng)元的單突觸神經(jīng)支配。用生物素標(biāo)記這些記錄神經(jīng)元的形態(tài)特征也支持這一觀點。

接下來，作者確定了ErbB4+神經(jīng)元和靶細胞之間的谷氨酸傳遞是否受到NRG1-ErbB4信號通路的調(diào)控。在給予NRG1后的15分鐘內(nèi)，光刺激誘發(fā)的EPSCs的波幅顯著增加，而這種作用在洗脫后減弱，表明NRG1促進谷氨酸傳遞。此外，給予ErbB4抑制劑阿法替尼降低了EPSC幅值，表明ErbB4激酶活性的參與谷氨酸傳遞。總之，這些數(shù)據(jù)證明了NRG1-ErbB4信號通路在脊髓谷氨酸傳遞中的作用。

8. NRG1-ErbB4信號通路參與病理性的熱痛過敏

在周圍神經(jīng)炎癥或損傷等病理條件下，機體對熱刺激的反應(yīng)更加敏感。在完全弗氏佐劑（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）引起炎癥性疼痛模型中，小鼠患肢在哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期顯著降低。以下證據(jù)能夠表明NRG1-ErbB4信號通路在炎癥引起的熱痛過敏中起作用。首先，NRG1和pErbB4在CFA注射小鼠的同側(cè)脊髓腰膨大中的表達增加。第二，在哈格里夫斯實驗中，鞘內(nèi)中和NRG1能夠增加小鼠撤足的潛伏期。第三，阿法替尼能夠抑制野生型小鼠的熱痛過敏，1NMPP1能夠抑制T796G小鼠的熱痛過敏。

此外，作者還研究了該通路在慢性壓迫性損傷（Chronic Constriction Injury, CCI）誘導(dǎo)的熱痛過敏反應(yīng)中的潛在作用。CCI能夠誘導(dǎo)小鼠在哈格里夫斯實驗中的反應(yīng)潛伏期降低，提示發(fā)生熱痛過敏。與假手術(shù)小鼠相比，CCI組小鼠同側(cè)腰膨大中NRG1和pErbB4的表達升高。野生型鞘內(nèi)給予ecto-ErbB4、阿法替尼、或T796G小鼠給予1NMPP1均可降低CCI引起的熱痛過敏。這些結(jié)果支持NRG1-ErbB4信號通路參與病理性的熱過敏的觀點。

總結(jié)

該研究通過分析熱刺激感受神經(jīng)元，識別出脊髓背角表層ErbB4在傷害性熱刺激的感受中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些ErbB4+神經(jīng)元顯示以下特性。首先，它們主要接收來自攜帶傷害性信息的Aδ和C纖維的單突觸傳入，而不是接受來自攜帶非傷害性信息的Aβ纖維傳入。其次，ErbB4+神經(jīng)元受DRG中TRPV1+傷害性傳入纖維的單突觸支配，對傷害性熱刺激反應(yīng)較好，而對機械刺激反應(yīng)較差。第三，消融或抑制ErbB4+神經(jīng)元減弱了動物在熱板、哈格里夫斯以及辣椒素實驗中的反應(yīng)，表明它們的活動與傷害性熱刺激的感受有關(guān)。最后，文章證明了NRG1-ErbB4信號通路在生理條件下的傷害性熱刺激感受和病理條件下的熱痛過敏反應(yīng)中的作用。

亮點研究方法

這項工作闡述了脊髓ErbB4+神經(jīng)元在傷害性熱刺激感受中的作用機制。研究用到了動物手術(shù)造模、行為學(xué)評估、光遺傳學(xué)、電生理記錄、組織病理檢測、給藥以及分子檢測等實驗技術(shù)。瑞沃德深耕生命科學(xué)研究領(lǐng)域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)，可提供該研究中涉及的動物手術(shù)造模、行為學(xué)評估、光遺傳學(xué)、電生理記錄、組織病理檢測、給藥以及分子檢測等實驗的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力科研人員發(fā)表SCI文章12000+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.04.021

倒置熒光顯微鏡MF52-N應(yīng)用于細胞

幾年來科學(xué)家正在開發(fā)細胞療法，希望能治療多種疾病和疑難雜癥。這就需要質(zhì)量控制和各種有關(guān)儀器設(shè)備來支持免疫療法和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。近期，明美上海區(qū)域安裝倒置熒光顯微鏡MF52-N，觀察mcherry熒光，應(yīng)用于細胞治療。

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來源：https://www.mshot.com/article/1716.html

文章概述

成年海馬神經(jīng)發(fā)生在記憶和情緒處理中起重要作用，海馬新生神經(jīng)元在DG中產(chǎn)生、成熟并整合到現(xiàn)有環(huán)路中，并且這個過程由神經(jīng)環(huán)路的活動進行動態(tài)調(diào)節(jié)。目前的研究主要關(guān)注神經(jīng)環(huán)路調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的某一階段，例如干細胞分裂、神經(jīng)前體細胞分化或者未成熟神經(jīng)元存活等等。然而，目前尚不清楚對神經(jīng)環(huán)路修飾的海馬新生神經(jīng)元對動物行為記憶的影響。

2022年5月6日，美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）宋娟課題組博士后李亞東、羅艷佳等人在Nature Neuroscience上發(fā)表了題“Hypothalamic modulation of adult hippocampal neurogenesis in mice confers activity-dependent regulation of memory and anxiety-like behavior”的最新研究，揭示了下丘腦后部核團乳頭上核（SuM）調(diào)控成年海馬神經(jīng)發(fā)生，促進記憶提取和對抗焦慮的新機制。

核心觀點

該研究聚焦于SuM-DG環(huán)路修飾的ABN及其發(fā)育的不同階段，通過光纖記錄、光遺傳、化學(xué)遺傳、膜片鉗和譜系示蹤等方法，揭示了SuM-DG環(huán)路修飾成年海馬新生神經(jīng)元，促進記憶提取和對抗焦慮。

研究結(jié)果分析

1. 作者以前的研究發(fā)現(xiàn)，SuM神經(jīng)元投射密集支配DG中成熟的顆粒細胞（GC），但SuM-DG 投射是否與神經(jīng)干細胞（rNSCs）形成功能連接尚不清楚。作者使用了共聚焦成像和3D重建方法，證明了SuM神經(jīng)元與DG中rNSCs存在連接，通過膜片鉗和光遺傳技術(shù)表明SuM-DG投射谷氨酸能從而激活rNSCs并促進rNSCs分裂。

SuM-DG投射谷氨酸能激活rNSCs并促進rNSCs分裂

2. 為了研究環(huán)路修飾對海馬神經(jīng)發(fā)生的影響，作者通過譜系示蹤、光遺傳和化學(xué)遺傳等方法，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)發(fā)生起始階段，SuM神經(jīng)元通過谷氨酸能誘導(dǎo)rNSCs的活化，并促進rNSCs分裂產(chǎn)生新的rNSCs和神經(jīng)前體細胞。

激活SuM神經(jīng)元促進rNSCs和神經(jīng)前體細胞的產(chǎn)生

3.接下來檢測SuM GABAergic在新生神經(jīng)元調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用。作者發(fā)現(xiàn)使用光遺傳激活SuM GABAergic神經(jīng)元能夠促進神經(jīng)前體分化，增加新生神經(jīng)元數(shù)量并促進樹突發(fā)育，敲除Vgat后該效應(yīng)消失。結(jié)果表明SuM GABAergic傳遞調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分化和早期未成熟神經(jīng)元發(fā)育。

SuM GABAergic傳遞調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分化和早期未成熟神經(jīng)元發(fā)育

4.由于成熟的 GC 接收雙 SuM GABAergic/glutamatergic輸入，作者想知道成年新生神經(jīng)元（ABN）是否也接收雙輸入。通過使用光遺傳和膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，DG中ABN接受GABAergic/glutamatergic雙輸入，且在ABN發(fā)育未成熟晚期階段，光遺傳激活SuM能夠增加未成熟神經(jīng)元、新生神經(jīng)元以及樹突棘的數(shù)量。結(jié)果表明SuM神經(jīng)元促進晚期階段成年新生未成熟神經(jīng)元的成熟和樹突棘發(fā)育。

SuM神經(jīng)元促進晚期階段成年未成熟神經(jīng)元的成熟和樹突棘發(fā)育

5. 已有研究ABN 活動對記憶和情緒行為至關(guān)重要，作者接下來檢測ABN活性對動物行為學(xué)的影響。作者選擇性激活SuM環(huán)路修飾的 ABN后進行新異位置識別（NPR）和場景性恐懼記憶（CFC）實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPR 測試中的辨別率和CFC中Freezing time增加，表明SuM 修飾的ABN的激活提高記憶性能。

激活SuM環(huán)路修飾的ABN改善記憶表現(xiàn)

6. 為了檢測SuM修飾的ABN在調(diào)節(jié)情緒處理中的作用，通過光遺傳和化學(xué)遺傳分別調(diào)控SuM環(huán)路修飾的ABN，并分別進行了曠場、O迷宮和強迫游泳測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SuM環(huán)路修飾的ABN活動，可進一步促進記憶提取，對抗焦慮樣行為。

SuM環(huán)路修飾的ABN活動可促進記憶提取和抗焦慮樣行為

7. 有研究表明SuM 神經(jīng)元的放電增加是對新異環(huán)境的反應(yīng)，作者接下來檢測新奇環(huán)境是否可以調(diào)節(jié)SuM-DG神經(jīng)元的活動。使用光纖記錄方法（瑞沃德R820三色多通道光纖記錄系統(tǒng)）檢測SuM-DG神經(jīng)元投射的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豐富環(huán)境（EE）中，小鼠SuM神經(jīng)元活性顯著增加。

瑞沃德R820三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

便捷高效 擴展性強

數(shù)據(jù)可視化 靈敏度高

SuM-DG神經(jīng)元在EE中活性增高

8. 由于 SuM 神經(jīng)元對新異環(huán)境具有高度反應(yīng)性，作者接下來檢測新異環(huán)境是否誘導(dǎo)這一反應(yīng)所必需的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SuM 消融后，EE誘導(dǎo)的神經(jīng)反應(yīng)和ABN介導(dǎo)的行為改善被消除。

消融SuM后EE誘導(dǎo)的神經(jīng)反應(yīng)和ABN介導(dǎo)的行為改善被消除

總結(jié)

該研究解決了一個長期存在的問題，即刺激神經(jīng)環(huán)路是否能夠產(chǎn)生足夠的神經(jīng)源性效應(yīng)來調(diào)節(jié)海馬體依賴性行為?？偟膩碚f，本文發(fā)現(xiàn)了SuM-DG神經(jīng)環(huán)路通過GABAergic/ glutamatergic輸入調(diào)控海馬ABN發(fā)育的全過程，并且提出了激活SuM-DG環(huán)路修飾的ABN能夠調(diào)控記憶和對抗焦慮的重要觀點。

光纖記錄可以檢測神經(jīng)核團及環(huán)路的信號變化，有助于探究腦區(qū)上下游投射及神經(jīng)元活性與行為學(xué)的關(guān)系。瑞沃德R820三色光纖記錄系統(tǒng)兼具數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析功能，紅綠熒光自由采集，同時兼具行為視頻與熒光數(shù)據(jù)同步記錄分析功能，讓實驗更為高效。

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