本生闡述:elisa操作步驟說明及注意事項
酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent
assay(簡寫ELISA),指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。要知道elisa操作步驟首先我們先了解一下elisa的原理是什么。
elisa的原理:
?、偈箍乖蚩贵w結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,
又保留酶的活性。在測定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體
上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,
產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)焰色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達到
很高的敏感度。
elisa操作步驟:
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被:用0.05M
PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。
2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。
4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。
5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越
強,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則
410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法:
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜。次日
洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔
中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體
以上是elisa操作步驟,那么在elisa操作步驟的操作步驟中需要注意什么呢?下面是elisa實驗的注意事項:
1.正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2.在elisa操作步驟中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:固相載體的選擇、包被抗體(或抗原)的選擇、酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇、酶的底物及供氫體的選擇
elisa試劑盒
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