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  雙木倩影 2010-04-19 00:00:00

  （一）四個原則 1．目的明確在設(shè)計新培養(yǎng)基前，首先要明確配制該培養(yǎng)基的目的，例如，要培養(yǎng)何菌？獲何產(chǎn)物？用于實驗室作科學(xué)研究還是用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)？作生產(chǎn)中的“種子”，還是用于發(fā)酵？等等。 如果某培養(yǎng)基將用于實驗室研究，則一般不必過多地計較其成本。但必須明確對該培養(yǎng)基是作一般培養(yǎng)用，還是作精細的生理、代謝或遺傳等研究用。如屬前者，可盡量按天然培養(yǎng)基的要求來設(shè)計，如系后者，則主要應(yīng)考慮設(shè)計一種組合培養(yǎng)基（即“合成培養(yǎng)基”，詳后）。擬培養(yǎng)的微生物對象也十分重要。不同大類的微生物，對培養(yǎng)基中碳源與氮源間的比例、pH的高低、滲透壓的大小、生長因子的有無以及特殊成分的添加等都要作相應(yīng)的考慮。 如果某培養(yǎng)基將用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)上，則用作“種子”的培養(yǎng)基，一般其營養(yǎng)成分宜豐富些，尤其氮源的含量應(yīng)較高（即C／N比低）；相反，如擬用作大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基，則從總體來說，它的氮源含量宜比“種子”培養(yǎng)基稍低（即C／N比高）。除了對不同類型的微生物應(yīng)考慮其特定條件外，在設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基時，還應(yīng)特別考慮到生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物是主流代謝產(chǎn)物，或是次生代謝產(chǎn)物。如屬主流代謝產(chǎn)物（一般指通過主要代謝途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)較簡單、產(chǎn)量較高、價值較低的降解產(chǎn)物），則生產(chǎn)不含氮的有機酸或醇類時，培養(yǎng)基中所含的碳源比例自然要比生產(chǎn)含氮的氨基酸類產(chǎn)物時高，反之，生產(chǎn)氨基酸類含氮量高的代謝產(chǎn)物時，氮源的比例就應(yīng)高些。如屬生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（一般是指通過復(fù)雜合成途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、產(chǎn)量低、價值高的合成產(chǎn)物），例如抗生素、維生素或赤霉素等，則還要考慮是否在其中加入特殊元素（如維生素B12中的Co）或特定前體物質(zhì)（如生產(chǎn)芐青霉素時加入的）。 2．營養(yǎng)協(xié)調(diào)通過菌體成分的分析，可知道在各種微生物的細胞中，其不同成分或元素間是有較穩(wěn)定比例的（表5-15）；另外，在異養(yǎng)微生物中，碳源還兼作能源，而能源的需要量是很大的。這兩點就是確定培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)要素的數(shù)量和比例的重要依據(jù)。此外，如果設(shè)計的培養(yǎng)基是用于生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的，那么，它所需耗費的營養(yǎng)物的量也要在設(shè)計培養(yǎng)基時予以充分考慮。 業(yè)已清楚，在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中，各營養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)律： 要素：H2O＞C+能源＞N源＞P、S＞K、Mg＞生長因子 含量：（～10-1）（～10-2）（～10-3）（～10-4）（～10-5）（～10-6） 從中可以看出：①水分含量Z高，這是因為微生物多數(shù)是水生性的，它們的aw值（詳后）高；②碳源的含量其次，這是因為碳元素在任何細胞有機物中都是含量Z高的，同時，碳源還兼有能源的作用，而能源的消耗量是很大的；③N、P、S、K、Mg的含量依次遞減，這是與它們分別在細胞組分中的含量是相符的；④生長因子的量Z少，這是與它的生理功能相一致的。 在上述序列中，碳源與氮源間的相對比例即碳氮比（C／N比），它有著十分重要的意義。嚴格地講，C／N比是指在微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中碳原子的摩爾數(shù)與氮源中氮原子的摩爾數(shù)之比，而不能簡單地理解為某碳源的重量與某氮源的重量之比。這是因為，不同種類的碳源或氮源，其中的含碳量或含氮量差別很大，從以下五種常用氮源的含氮量占總重量的比例即可明白其中的道理： NH3（含氮量82％）＞CO（NH2）2（46％）＞NH4NO3（35％）＞（NH4）2CO3（29.2％）＞（NH4）2SO4（21％）這說明在同樣重量時，在以上各氮源中含氮量以氨為Z高，尿素次之，硝酸銨和碳酸銨更次之，而硫酸銨則Z低。 據(jù)記載，一般培養(yǎng)基的C／N比為100／0.5～2；谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為100／11～21，放線菌蛋白酶培養(yǎng)基為100／10～20。 3．物理化學(xué)條件適宜 （1）pH 各大類微生物一般都有它們合適的生長pH范圍。細菌的Z適pH在7.0～8.0間，放線菌在7.5～8.5間，酵母菌在3.8～6.0間，而霉菌則在4.0～5.8間。對于具體的微生物種來說，它們都有特定的Z適pH范圍，有時可大大突破上述一般界限（見第七章第三節(jié)）。 由于在微生物生長繁殖過程中會產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，尤其是不少的微生物有很強的產(chǎn)酸能力，如不適當?shù)丶右哉{(diào)節(jié)，就會YZ甚至殺死其自身，因而在設(shè)計它們的培養(yǎng)基時，就要考慮到培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)能力。這種通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，就是pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)。 內(nèi)源調(diào)節(jié)主要有以下兩種方法： diyi種是采用磷酸緩沖液的方式。調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比就可獲得從pH6.0至7.6間的一系列穩(wěn)定的pH，當兩者為等摩爾濃度比時，溶液的pH可穩(wěn)定在pH6.8。其反應(yīng)原理如下： K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KCl KH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O 第二種是采用加入CaCO3作“備用堿”的方式。CaCO3在水溶液中溶解度極低，加入至液體或固體培養(yǎng)基中時，不會使培養(yǎng)液的pH升高。但當微生物生長過程中不斷產(chǎn)酸時，它就逐漸被溶解，并發(fā)生以下反應(yīng)： 因為CaCO3是不溶性且是沉淀性的，故在配成的培養(yǎng)基中分布很不均勻，如因?qū)嶒炐枰?，也可用NaHCO3來調(diào)節(jié)： 與內(nèi)源調(diào)節(jié)相對應(yīng)的是外源調(diào)節(jié)，這是一種按實際需要不斷流加酸液或堿液到培養(yǎng)液中去的調(diào)節(jié)方法。具體內(nèi)容將在第七章第三節(jié)中進行討論。 （2）滲透壓和aw 滲透壓（osmoticpressure）是可用壓力來量度的一個物化指標，它表示兩種濃度不同的溶液間被一個半透性薄膜隔開時，稀溶液中的水分子會透過此膜到濃溶液中去，直到濃溶液產(chǎn)生的機械壓力足以使兩邊的水分子進出達到平衡為止，這時由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機械壓力，即為滲透壓。滲透壓的大小是由溶液中所含有的分子或離子的質(zhì)點數(shù)所決定的，等重的物質(zhì)，其分子或離子越小，則質(zhì)點數(shù)越多，因而產(chǎn)生的滲透壓就越大。 等滲溶液適宜微生物的生長，高滲溶液會使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，而低滲溶液則會使細胞吸水膨脹，對細胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細胞（如原生質(zhì)體、球狀體，支原體）來說，在低滲溶液中還會破裂。 微生物在其長期的進化過程中，發(fā)展出一套高度適應(yīng)滲透壓的特性，尤其會通過體內(nèi)大分子貯藏物的合成或分解的方式來適應(yīng)。據(jù)測定，革蘭氏陽性細菌的內(nèi)滲透壓約可達到20個大氣壓，而革蘭氏陰性細菌也可達到5～10個大氣壓。 比滲透壓更有生理意義的一個物化指標是aw即水活度（wateractivity）。它表示在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量。要定量地表示水活度，則其含義為：在同溫同壓下，某溶液的蒸汽壓（P）與純水蒸汽壓（P0）之比。因此，aw也等于該溶液的百分相對濕度（ERH，equilibriumrelativehumidity）值。即： 各種微生物生長繁殖范圍的aw值在0.998～0.6之間。若干有代表性微生物的Z低aw值是： 知道了各類微生物生長的aw值，不僅有利于設(shè)計它們的培養(yǎng)基，而且對防止食物的霉腐也有重要的意義?，F(xiàn)將若干食物的aw值列舉如下： （3）氧化還原勢 氧化還原勢（redoxpotential）又稱氧化還原電位，是度量某氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標，其單位是V（伏）或mV（毫伏）。氧化還原勢的表示方法Eh或rH2兩種。 Eh指以氫電極為標準時某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值。標準氫電極是一個半電池，它由pH為零的HCl溶液、涂滿鉑黑的鉑箔電極和用壓力為1個大氣壓的氫所組成的。在這種條件下，此標準氫電極的電極電位等于零。在溶液中的某氧化還原偶，當其氧化型和還原型的濃度相等時，所產(chǎn)生的氧化還原勢可用E0表示。任何氧化還原系統(tǒng)所產(chǎn)生的氧化還原勢明顯地受pH的影響。在生物體系中，常用E′來表示pH為7時某氧化還原偶的氧化還原勢。氫電極E′的上限是+0.82V，它出現(xiàn)在高氧且沒有氧消耗的環(huán)境中，下限為-0.42V，出現(xiàn)在富含氫的環(huán)境中。 任何一對由氧化態(tài)物質(zhì)與還原態(tài)物質(zhì)組成的氧化還原偶，在pH等于7的情況下會產(chǎn)生一定的氧化還原勢，其數(shù)值可借它與一個標準氫電極間所呈現(xiàn)出來的電位差值來測出。由于氫電極在使用時極感不便，因此，實際上常用甘汞電極作參比電極來進行測定。某一氧化還原系統(tǒng)在30℃下所產(chǎn)生的氧化還原勢數(shù)值為： 上式中的n為反應(yīng)中所傳遞的電子數(shù)，〔ox〕為測定系統(tǒng)中某氧化態(tài)物質(zhì)的濃度，〔red〕為該還原態(tài)物質(zhì)的濃度。 rH2表示氫分子濃度的負對數(shù)，這一概念與pH是氫離子濃度的負對數(shù)的概念有類似之處。其數(shù)值為： rH2的范圍自0（氫濃度等于1個大氣壓）至42.6（氧濃度為1個大氣壓）。這就意味著，某溶液的rH2值越低，它的還原力越強，反之，如rH2值越高，則其氧化性越強。從式中還可以看出Eh、rH2與pH值三者間的關(guān)系。當Eh值不變時，pH值越高，rH2亦越高，pH值越低，則rH2值亦越低。在許多氧化還原系統(tǒng)中，每降低一個pH值，就相當于提高Eh值0.06V。 就像微生物與pH的關(guān)系那樣，各種微生物對其培養(yǎng)基的氧化還原勢也有不同的要求。一般地說，適宜于好氧微生物生長的Eh值為+0.3～+0.4V，它們在Eh值為0.1V以上的環(huán)境中均能生長；兼性厭氧微生物在＋0.1V以上時進行好氧呼吸，在+0.1V以下時則進行發(fā)酵；厭氧微生物只能在+0.1V以下才能生長。 微生物的培養(yǎng)基常常是一個具有多對氧化還原偶的復(fù)雜電化學(xué)系統(tǒng)，這時所能測出的Eh值僅代表了它們的綜合結(jié)果。在各對氧化還原偶中，對微生物生長繁殖影響Z大的是分子氧與分子氫的濃度，它們對嚴格厭氧菌的影響尤為重大。要培養(yǎng)它們，除了在配制培養(yǎng)基、滅菌、接種和培養(yǎng)等一切操作過程中必須采用嚴格厭氧技術(shù)（見第七章第三節(jié)）以去除氧氣外，還要在培養(yǎng)基中加入一定量的還原劑，例如可用巰基乙酸（0.01～0.20％）、抗壞血酸（0.1％）、硫化鈉（0.025％）、半胱氨酸（＜0.05％）、葡萄糖（0.1～1.0％）、鐵屑、谷胱甘肽、氯化高鐵血紅素、二硫蘇糖醇或庖肉（瘦牛肉小塊）等來降低它的氧化還原勢值。據(jù)測定，加了鐵屑的培養(yǎng)基，其Eh值可降到－0.40V的水平。 除測定電極電位外，培養(yǎng)基中的Eh值還可使用氧化還原指示劑如刃天青（resazurin）等來測定。刃天青在培養(yǎng)基中的加入量一般為1mg／L（1ppm）。它在無氧條件下呈無色狀態(tài)，這時的Eh值相當于－40mV左右；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH有關(guān)（中性時呈紫色，堿性時呈藍色，酸性時呈紅色）；在微量氧時，它呈粉紅色。刃天青的變色反應(yīng)機理是： 不論是好氧微生物還是厭氧微生物，隨著它們的生長和代謝活動的進行，培養(yǎng)基的Z初氧化還原勢常會逐步下降。其原因主要是因為溶解氧和氧化型氫受體的消耗和H2S、H2等還原性代謝產(chǎn)物的形成和累積。圖5-2表示在Streptomycesaureofaciens（金霉素鏈霉菌）K1001的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液氧化還原勢值的變化及其與產(chǎn)生金霉素的關(guān)系。 4．經(jīng)濟節(jié)約 經(jīng)濟節(jié)約主要指在設(shè)計生產(chǎn)實踐中所使用的大量培養(yǎng)基時應(yīng)遵循的原則。這方面的潛力是極大的。綜合各方面的實際經(jīng)驗，經(jīng)濟節(jié)約的原則大體可分為以下八個方面。 （1）以粗代精 一般地說，“粗”與“精”的概念是人為劃分的。對人來說是一種“精”的營養(yǎng)料（如精白糖），對微生物往往卻是一種不完全的養(yǎng)料，而對一般人只認為是“粗”的營養(yǎng)料（如紅糖），對微生物倒反而是一種較完全的養(yǎng)料。從這一點出發(fā)，就可以在設(shè)計培養(yǎng)基時充分利用各種粗原料。 （2）以“野”代“家” 主要指以野生植物原料代替栽培植物原料。如木薯、橡子、薯芋、土茯苓、金剛刺和苦楝子等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物，可以部分取代糧食用于發(fā)酵工業(yè)中的碳源；許多含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的植物秸稈，可以作為栽培食用菌的良好養(yǎng)料。 （3）以廢代好 以工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為微生物培養(yǎng)基的原料，是大有可為的，例如，造紙廠的亞硫酸廢液（含有戊糖和短小纖維）、各種發(fā)酵廢液（酒精及丙酮丁醇發(fā)酵廢醪、味精發(fā)酵廢液）、各種釀造工業(yè)廢棄物（啤酒糟、酒糟、醬渣）以及其他工業(yè)廢棄物（花生麩、淀粉渣、胚芽餅、豆腐渣、屠宰水、黃漿水、蠶繭脫膠廢水、粉絲廠廢水）等。在利用這類原料生產(chǎn)酵母菌等單細胞蛋白方面，國內(nèi)外已有很多成功的例子。 （4）以簡代繁 生產(chǎn)上在改進培養(yǎng)基成分時，一般都以“加法”居多，即設(shè)法使其營養(yǎng)越來越豐富、含量越來越高。這對微生物的生長不一定都有利。有時可SY“減法”，即用稀薄的培養(yǎng)基或成分較少的培養(yǎng)基來代替原有培養(yǎng)基成分，以求達到更好的效果。例如，某制藥廠在改進鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基原有配方中，曾設(shè)法減去30～50％的黃豆餅粉、25％葡萄糖和20％硫酸銨，結(jié)果反而提高了產(chǎn)量（表5-16）；又如，某廠在卡那霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中將原來的12種成分減少為7種，結(jié)果仍可維持原有的產(chǎn)量。 （5）以烴代糧 即以石油或天然氣代替糖質(zhì)原料來培養(yǎng)微生物。能利用石油作為碳源和能源的微生物在自然界中普遍存在，據(jù)知至少有8屬細菌、6屬放線菌、6屬酵母和6屬霉菌能利用石油。不同的微生物幾乎能利用石油中所含的所有成分，除了合成菌體成分——石油蛋白外，還能將其氧化成醇、醛、酸等化工產(chǎn)品。在當前石油資源逐漸趨向緊缺的情況下，如能拿出一部分石油作發(fā)酵原料，讓微生物將它轉(zhuǎn)化成一些產(chǎn)值較高的高級醇、脂肪酸和環(huán)烷酸等化工產(chǎn)品和若干合成產(chǎn)物，還是十分值得的。 （6）以纖代糖 纖維素是一種由14000個左右的葡萄糖單位構(gòu)成的β-D-葡萄糖長鏈，是自然界中Z豐富的有機物?？墒?，人類和動物都無法直接消化這一取之不盡、用之不竭的可再生資源。在自然界中，存在著大量分解纖維素的微生物，它們能分泌各種纖維素酶，例如內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶（分解大分子ZY的β-1，4鍵，產(chǎn)生含游離末端的長鏈片段），外-β-1，4-葡聚糖酶（從纖維素鏈的末端上不斷水解出纖維二糖單位），以及β-葡糖苷酶（將纖維二糖水解成葡萄糖）。因此，有可能利用這些微生物將大量的農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料以及人類的食品或飲料。例如有的國家利用Candidawickerharmii（維氏假絲酵母）將纖維糊精通過3～4天發(fā)酵產(chǎn)生乙醇（54g／L纖維糊精可產(chǎn)生29.2g／L乙醇）；也有用Clostridiumthermocellum（熱纖梭菌）在55～60℃下的厭氧條件下將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，然后再轉(zhuǎn)化為乙醇；在日本，有人用厭氧菌Ruminococcusalbus（白色瘤胃球菌）將球磨纖維素（80g／L）發(fā)酵產(chǎn)生酒精（18g／L）和醋酸（23g／L）；目前，優(yōu)良的Trichodermaviride（綠色木霉）變異株每毫升發(fā)酵液的纖維素酶活力已超過7500單位；近來，還有人找到一株能利用纖維素生產(chǎn)乙醇的耐熱性酵母——Fabosporafragilis（脆弱豆孢酵母）CCY51-1-1。這些都為“以纖代糖”提供了令人鼓舞的應(yīng)用前景。據(jù)估計，我國每年有稻草、麥稈、稻殼、棉子殼和玉米芯五項含纖維素豐富的資源4億噸以上，如能充分加以利用，這將是一個巨大的生物資源庫。 （7）以氮代朊 即以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用（見本章diyi節(jié)“氮源”）。 （8）以“國”代“進” 即以國產(chǎn)原料代替進口原料，這實際上是“以粗代精”原則的一種特殊形式。典型的例子是50年代初在我國建立抗生素工業(yè)的早期，因為國內(nèi)缺乏乳糖及玉米漿這兩種青霉素發(fā)酵的主要原料而影響到生產(chǎn)的發(fā)展。我國學(xué)者經(jīng)過研究，終于找到了以國內(nèi)資源極其豐富的棉子餅粉或花生餅粉代替玉米漿，以玉米粉代替進口乳糖的新的培養(yǎng)基配方，后來又進一步以流加葡萄糖代替乳糖的新工藝，使青霉素產(chǎn)量超過當時國外乳糖發(fā)酵的水平，從而建立了具有ZG特色的青霉素發(fā)酵工業(yè)。 （二）四種方法 1．生態(tài)模擬 在自然條件下，凡有某微生物大量生長繁殖的環(huán)境，則可認為該處一定具備該微生物生長繁殖所必需的營養(yǎng)和其他條件。因此，就可以模擬該天然基質(zhì)或直接取用該天然基質(zhì)（經(jīng)過滅菌）來培養(yǎng)相應(yīng)的微生物。在實踐中，的確可以利用生態(tài)模擬的辦法來配制各類“初級的”天然培養(yǎng)基。例如，可用肉湯、魚汁來培養(yǎng)多種細菌；用水果汁來培養(yǎng)各種酵母菌；用潤濕的麩皮、米糠來培養(yǎng)多種霉菌；用米飯或面包來培養(yǎng)根霉；用肥土來培養(yǎng)放線菌；以及用玉米芯來培養(yǎng)脈孢菌（Neurosporaspp.），等等。 2．查閱文獻 一個科學(xué)工作者決不能事事都依靠直接經(jīng)驗。多查閱、分析和利用一切文獻資料上的對自己直接或間接有關(guān)的信息，對設(shè)計有自己特色的培養(yǎng)基配方有著重要的參考價值。 3．精心設(shè)計 在設(shè)計、試驗新配方時，常常要進行各項因素的比較或反復(fù)試驗，因此，工作量是很大的。為了提高工作效率，應(yīng)努力借助優(yōu)選法或正交試驗設(shè)計法等行之有效的數(shù)學(xué)工具。 4．試驗比較 要設(shè)計一種優(yōu)化的培養(yǎng)基，在上述三個方法的基礎(chǔ)上，Z終還得通過實際試驗和比較來加以確定。試驗的規(guī)模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步擴大的原則。例如，可先在培養(yǎng)皿上作生長譜試驗（auxanographicmethod），然后進行搖瓶培養(yǎng)試驗，再進行臺式發(fā)酵罐試驗，Z后才擴大到試驗型發(fā)酵罐和生產(chǎn)型發(fā)酵罐的規(guī)模。 生長譜試驗的基本操作是這樣的：如果我們要試的是某一微生物的碳源，則先準備一個不加碳源的瓊脂培養(yǎng)基，待融化并冷卻至45℃左右時，混入供試菌懸液，搖勻后倒成瓊脂平板，俟其凝固后，將待試碳源一一用小鑷子夾取少許并整齊地放在平板上。經(jīng)溫箱培養(yǎng)適當時間后，凡在某碳源周圍出現(xiàn)該菌的“生長圈”者，即為它可利用的碳源。用同樣原理也可尋找合適氮源和生長因子。

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