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  走巴走巴 2007-06-28 00:00:00

  提取目的基因，目的基因與運載體結(jié)合，目的基因?qū)胧荏w細胞，目的基因的檢測與鑒定。

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  towerrt 2007-06-28 00:00:00

  基因工程的基本過程： 1、材料的準備：目的基因、載體、工具酶和受體細胞（宿主）的準備。用相同的限制 性內(nèi)切酶分別將外源DNA和載體分子切開，以產(chǎn)生相同的黏性末端。 2、 將目的基因與載體DNA進行體外重組，形成重組DNA分子。 3、 將重組的DNA分子引入受體細胞，并建立起無性繁殖系。 4、 篩選出所需要的目的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細胞中穩(wěn)定遺傳、正確 表達。 可將基本步驟概括為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。

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  一只小鳥5711 2016-12-01 17:48:01

  是基因工程吧 基因工程簡介 我們常常說基因是生物體進行生命活動的“藍圖”，這是因為生物體可以通過基因的特異性表達，來完成各種生命活動。例如，青霉菌能夠產(chǎn)生出對人類有用的抗生素——青霉素；豆科植物的根瘤菌能夠固定空氣中的氮；家蠶能夠吐出絲……那么，人們能不能通過改造生物體的基因，定向地改變生物的遺傳特性呢？比如，通過對基因進行改造和重新組合，讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮，讓細菌“吐出”蠶絲，讓微生物生產(chǎn)出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物?？茖W(xué)家們經(jīng)過多年的努力，終于在20世紀70年代，創(chuàng)立了一種能夠定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。那么，什么是基因工程呢？基因工程又是怎樣改變生物遺傳特性的呢？ 一 基因工程的基本內(nèi)容 基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。這種技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。通俗地說，就是按照人們的主觀意愿，把一種生物的個別基因復(fù)制出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。 基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。DNA分子的直徑只有2.0nm(粗細只有頭發(fā)絲的十萬分之一)，其長度也是極其短小的。如流感嗜血桿菌的DNA，長度只有0.83?m，即使是較大的大腸桿菌，其長度也只有1.36?m。要在如此微小的DNA分子上進行剪切和拼接，是一項非常精細的工作，必須要有專門的工具。 基因操作的工具 用什么樣的工具才能準確無誤地對基因進行剪切和拼接呢？這是從事基因工程研究的科學(xué)家首先遇到的難題。例如，通過基因工程培育抗蟲棉時，就需要將抗蟲的基因從某種生物(如蘇云金芽孢桿菌)中提取出來，“放入”棉的細胞中，與棉細胞中的DNA結(jié)合起來，在棉中發(fā)揮作用。這里遇到的難題主要有兩個：首先是蘇云金芽孢桿菌的一個DNA分子有許多基因，怎樣從它的DNA分子的長鏈上辨別出所需要的基因，并且把它切割下來。其次是如何將切割下來的抗蟲基因與棉的DNA“縫合”起來。為了突破這些難關(guān)，科學(xué)家進行了許多試驗，Z后他們發(fā)現(xiàn)了一種“基因剪刀”和“基因針線”，可以用來完成基因的剪切和拼接。 基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶 基因的剪刀指的是DNA限制性內(nèi)切酶(以下簡稱限制酶)。限制酶主要存在于微生物中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子(如圖)。例如，從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制酶只能識別GAATTC序列，并在G和A之間將這段序列切開。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了二百多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，就能被某種限制酶切割下來。 基因的針線——DNA連接酶 從圖中可以看出，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫做黏性末端?？梢栽O(shè)想，如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，似乎就可以合成重組的DNA分子了。但是，實際上僅僅這樣做是不夠的，互補的堿基處雖然連接起來，但是這種連接只相當(dāng)于把斷成兩截的梯子中間的踏板連接起來，兩邊的扶手的斷口處還沒有連接起來(如圖)。要把扶手的斷口處連接起來，也就是把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來，還要靠另一種極其重要的工具——DNA連接酶。 基因的運輸工具——運載體 要將一個外源基因，如上面所說的抗蟲基因，送入受體細胞，如棉細胞，還需要有運輸工具，這就是運載體。作為運載體的物質(zhì)必須具備以下條件：能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。目前，符合上述條件并經(jīng)常使用的運載體有質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。 質(zhì)粒是基因工程Z常用的運載體，它廣泛地存在于細菌中，是細菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細菌染色體DNA的百分之一(如圖)。質(zhì)粒能夠“友好”地“借居”在宿主細胞中。一般來說，質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。但是，質(zhì)粒的復(fù)制則只能在宿主細胞內(nèi)完成。 大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌等細菌中都有質(zhì)粒。因為土壤農(nóng)桿菌很容易感染植物細胞，所以科學(xué)家培育轉(zhuǎn)基因植物時，常常用土壤農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒做運載體。 基因操作的基本步驟 進行基因操作一般要經(jīng)歷四個基本步驟，也就是基因操作的“四步曲”。 提取目的基因 基因操作的diyi步，是取得人們所需要的特定基因，也就是目的基因(如圖)。如前 面提到的蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因，還有植物的抗病(抗病毒、抗細菌)基因、 種子的貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等，都是目的基因。 要從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定的目的基因，猶如大海撈針，是十分不易的?？茖W(xué)家們經(jīng)過不懈地探索，想出了許多辦法，概括地說，主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。 直接分離基因Z常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。這種方法猶如用發(fā)射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴增)，從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲、抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。 用“鳥槍法”獲取目的基因的缺點是工作量大，具有一定的盲目勝。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，不能直接用于基因的擴增和表達，因此，在獲取真核細胞中的目的基因時，一般是用人工合成基因的方法。 目前人工合成基因的方法主要有兩條途徑。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)的方法，以單核苷酸為原料合成目的基因(如圖)。如人的血紅蛋白基因、胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。 20世紀80年代以后，隨著DNA核苷酸序列分析技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以通過DNA序列自動測序儀(見本章題圖左上照片)對提取出來的基因進行核苷酸序列分析，并且通過一種擴增DNA的新技術(shù)(也叫PCR技術(shù))，使目的基因片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。上述新技術(shù)的出現(xiàn)大大簡化了基因工程的操作技術(shù)。 目的基因與運載體結(jié)合 將目的基因與運載體結(jié)合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質(zhì)粒作為運載體，首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。然后用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因堿基互補配對而結(jié)合，形成了一個重組DNA分子(如圖)。如人的胰島素基因就是通過這種方式與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合，形成重組DNA分子(也叫重組質(zhì)粒)的。 將目的基因?qū)胧荏w細胞 目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子后，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增(如圖)。 基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。 用人工的方法使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。例如，如果運載體是質(zhì)粒，受體細胞是細菌，一般是將細菌用氯化鈣處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。目的基因?qū)胧荏w細胞后，就可以隨著受體細胞的繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。 目的基因的檢測和表達 以上步驟完成以后，在全部受體細胞中，真正能夠攝入重組DNA 分子的受體細胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對受體細胞中是否導(dǎo)入了目的基因進行檢測。檢測的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細胞后，就可以根據(jù)受體細胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因。 重組的DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。例如，科學(xué)家Z初做抗蟲棉試驗時，雖然已經(jīng)檢測出棉的植株中含有抗蟲的基因，但讓棉鈴蟲食用棉的葉片時，棉鈴蟲并沒有被殺死，這說明抗蟲基因還不能在高等植物中表達。科學(xué)家在研究的基礎(chǔ)上，又一次對棉植株中的抗蟲基因進行了修飾，然后再讓棉鈴蟲食用棉的葉片，結(jié)果食用的第二天棉鈴蟲就中毒死亡了。這說明抗蟲基因在棉植株中得到了表達

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