ELISA試劑盒中常用的方法類型!

　　ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的簡稱，即酶聯(lián)免疫吸附測定，是研究蛋白抗體的重要方法。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶進行直接或間接結(jié)合，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進行定性和定量分析。我們一起聊聊常見的商業(yè)化ELISA試劑盒的方法種類以及它們各自的優(yōu)勢和用途：

　　ELISA大致分為五種類型：直接法、間接法、競爭法、夾心法、捕獲包被法。在商品化試劑盒中用得比較多的是雙抗體夾心法、競爭法和間接法。

　　雙抗體夾心法是夾心法中的一種主要形式，我們先談?wù)剨A心法吧：

　　夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　　雙抗體夾心法中抗原的2個不同的抗原表位被兩個抗體-捕捉抗體和檢測抗體，分別結(jié)合。捕捉抗體固定于載體即酶標(biāo)板上，檢測抗體通過結(jié)合抗原進行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因為以多抗作為捕捉抗體容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)而降低特異性。檢測抗體通常為多抗，在商業(yè)化的科研試劑盒中經(jīng)常用到生物素標(biāo)記的山羊多抗，再讓生物素標(biāo)記的多抗與HRP標(biāo)記的親和素或者鏈霉親和素結(jié)合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應(yīng)顯色，這種方法是在傳統(tǒng)的HRP酶標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了生物素-親和素放大系統(tǒng)。

　　不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢，但該法只適用于有多個結(jié)合位點的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測細胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時會將樣本和酶標(biāo)抗體同時加入進行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因為操作時間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)(hook ffect)，因為此時如果樣本中抗原含量過高會導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無法形成“夾心復(fù)合物”，此時測出的結(jié)果將低于實際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。

　　雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，在醫(yī)學(xué)檢驗上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定，故此靈敏度相對而言高于我們隨后要說的間接法。

　　競爭法也是一種很常用的方法，一起看看：

　　競爭法是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競爭性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體(或抗原)濃度越高，則能與固定抗原(或抗體)結(jié)合的酶標(biāo)抗體(或抗原)就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對照相比，顯色越淺，表示檢測樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測也可用于檢測比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點，不適用于雙抗夾心法進行測定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣泛運用。

　　最-后再說說間接法，間接法只能用于測定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。間接法使用了二抗增加信號強度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

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重組抗體，也被稱為重組免疫球蛋白，是通過基因工程技術(shù)將抗體的基因在合適的宿主細胞中表達并生產(chǎn)出來的一類抗體。與傳統(tǒng)的多克隆抗體和單克隆抗體相比，重組抗體具有更高的特異性和親和力，并且可以針對特定的抗原表位進行設(shè)計和優(yōu)化。

重組抗體的類型包括嵌合抗體、雙特異性抗體、抗體片段和Fc融合蛋白等。下面一起來看一下他們各種的應(yīng)用：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/recombinant-antibody-overview

①嵌合抗體

1975年，雜交瘤技術(shù)的發(fā)現(xiàn)徹底改變了抗體研究和臨床開發(fā)。然而，鼠源性抗體的療-效受到人抗鼠抗體（HAMA）效應(yīng)的限制，鼠源性單抗對人體具有異種蛋白的免疫原性 ,在人體內(nèi)半衰期較短。1984年，研究人員通過基因工程構(gòu)建了第一個嵌合抗體，也是公認的第一種重組抗體，以降低鼠源抗體在人體內(nèi)的免疫原性。其中，約30%-35%的分子來源于小鼠的抗體序列，約65%-70%來源于人的抗體序列。所得嵌合抗體保留了親代小鼠抗體的抗原結(jié)合能力?？贵w嵌合是開發(fā)治-療性人源化抗體的第一步。義翹神州采用CDR移植技術(shù)和計算機輔助分子建模，提供高質(zhì)量的單克隆抗體人源化服務(wù)，成功率高，人源化程度>90%。

②抗體片段

每一個完整的免疫球蛋白（IgG）分子包含通過二硫鍵連接的兩條重鏈和兩條輕鏈?？贵w片段（如Fab、scFv和VHH）體積小，比其全長抗體具有更好的組織或腫瘤穿透力。因此，它們在免疫治-療方面具有巨大的前景，尤其是在實體瘤方面。此外，它們的半衰期也較短，可用作放射性顯像劑。然而，由于缺乏Fc區(qū)，它們不能引起Fc介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能，如抗體依賴性細胞毒性（ADCC）和補體依賴性細胞毒性（CDC）。

起初采用酶解法對IgG抗體進行片段化。胃蛋白酶作用于鉸鏈區(qū)二硫鍵所連接的兩條重鏈的近C端，水解產(chǎn)生被稱為F(ab’)2的二價Fab片段。然后，通過木瓜蛋白酶將該片段裂解為兩個相同的Fab片段。然而，酶解法限制了可制備的抗體片段類型，而且不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和純化。隨著抗體工程技術(shù)的進步，這些問題可以通過重組生產(chǎn)抗體片段來解決?？贵w基因克隆測序成功后，可通過瞬時轉(zhuǎn)染在原核表達系統(tǒng)（如大腸桿菌）和哺乳動物系統(tǒng)（HEK293細胞）中表達抗體片段。

憑借豐富的重組生產(chǎn)經(jīng)驗，義翹神州建立了高通量VHH表達平臺，交付了多個VHH抗體生產(chǎn)項目，總體成功率超過90%。除了常見的VHH形式，我們還可以表達雙特異和多特異VHH。此外，義翹神州還可以表達其他各種高特異性和親和力的抗體片段，如scFv和Fab。

③雙特異性抗體

與常規(guī)單克隆抗體不同，雙特異性抗體（bsAb）具有兩個結(jié)合位點，可識別同一抗原上兩個不同抗原或表位。由于這一特性，雙特異性抗體備受研究者和制藥業(yè)的關(guān)注。截止目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)了4種雙抗藥物，而且160多種雙抗正在進行臨床試驗，用于治-療癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病和其他疾病。

起初，雙特異性抗體通過四源雜交瘤技術(shù)制備，但這對下游抗體生產(chǎn)和純化構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。隨著過去20年重組DNA技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了幾種雙特異性抗體形式，以適應(yīng)所需的靶標(biāo)-產(chǎn)品特征。為了解決重鏈錯配問題，Genentech首先提出了“knob-into-hole”（KiH）技術(shù)，該技術(shù)通過對CH3結(jié)構(gòu)域進行改造，在每條重鏈中創(chuàng)建一個“knob”或一個“hole”，以誘導(dǎo)異源二聚化。同樣地，研究人員也采用了common light chain 和CrossMab等其他技術(shù)來解決輕鏈錯配問題。表達雙特異性抗體主要在哺乳動物細胞中進行。由于單克隆抗體和雙特異性抗體之間的各種結(jié)構(gòu)相似性，許多已建立的常規(guī)單抗純化工藝也可適用于雙特異性抗體。（參見另一篇文章：“雙特異性抗體：抗體治-療中的新星”）

④Fc融合蛋白

Fc融合蛋白（又稱Fc嵌合融合蛋白、Fc-Ig和Fc標(biāo)簽蛋白）是一種同源二聚體，由免疫球蛋白的Fc段與具有生物學(xué)活性的蛋白分子組成。雖然單克隆抗體是治-療性生物制劑開發(fā)的重-點，但Fc融合蛋白也是一類成功的生物制藥產(chǎn)品，至少有13種藥物獲得了歐洲藥品管理局（EMA）和美國FDA的批準(zhǔn)。除治-療應(yīng)用外，F(xiàn)c融合蛋白還是基礎(chǔ)研究中的檢測試劑，包括流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)和蛋白結(jié)合試驗。事實上，與Fc區(qū)的連接可以提高一些結(jié)合蛋白的溶解度和穩(wěn)定性。鑒于其大小和對糖基化的需求（大多數(shù)是糖蛋白），F(xiàn)c融合蛋白主要在哺乳動物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。

目前，抗體工程技術(shù)取得了一定的進步，這極大地促進了各種形式重組抗體的開發(fā)，用于疾病治-療。FDA已批準(zhǔn)了100多種抗體藥物，目前有多種抗體處于臨床后期開發(fā)階段。此外，重組抗體還可用于許多研究應(yīng)用：蛋白免疫印跡（WB）、免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫熒光（IF）、流式細胞術(shù)（FC）和表面等離子體共振（SPR）。

總之，重組抗體是基因工程技術(shù)的重要應(yīng)用之一，其類型多樣，具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組抗體的生產(chǎn)成本和安全性問題也將得到進一步優(yōu)化，為臨床治-療和科學(xué)研究提供更多有效的工具。同時，我們也應(yīng)該認識到重組抗體的潛在風(fēng)險和挑戰(zhàn)，加強對其安全性和有效性的評估和監(jiān)管，以確保其能夠更好地服務(wù)于人類的健康事業(yè)。

更多重組抗體詳情關(guān)注：https://cn.sinobiological.com/news/recombinant-antibodies-formats

　　Elisa實驗：Elisa如果加樣，有哪些小竅門!

　　ELISA實驗中，加樣 一定是繞不開的一環(huán)!ELISA測定操作非常簡單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

　　ELISA實驗中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

　　● 實驗室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導(dǎo)致讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來誤差。

　　● 加樣前，溶液充分混勻，加樣時不可90度向孔中滴加液體，否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

　　● 加樣品時，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

　　● 加樣時速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

　　● 加樣時避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。

　　● 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個孔顯色時間相同。

　　● 加完顯色液后，放入一個可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了。

　　| 加樣防錯小竅門

　　● 用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。

　　● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。

　　ELISA 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。