實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)板步驟

　　1、細(xì)胞復(fù)蘇

　　將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。將融化的細(xì)胞移入離心管中，加入37℃預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基中(其中胎牛血清約為10%)，輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

　　加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/瓶中，在含5%  CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　2、細(xì)胞傳代

　　當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%(過(guò)早產(chǎn)量不足，過(guò)晚細(xì)胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng)，一般1:3至1:5細(xì)胞一代，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間，非細(xì)胞有絲分裂次數(shù))時(shí)，去掉培養(yǎng)基，用1X  PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以蓋住細(xì)胞，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀(guān)察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度)進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

　　加入適量DMEM培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。

　　加入DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照所需細(xì)胞量在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3、細(xì)胞凍存

　　當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，去掉培養(yǎng)基，用1X   PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清，10%DMSO。   一般來(lái)講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中加入血清一方面可以為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，另一方面可以在細(xì)胞凍存過(guò)程中提供非滲透性保護(hù)物質(zhì)，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護(hù)細(xì)胞)，放入凍存管內(nèi)(管內(nèi)有異丙醇，以溫度降低的速度)，立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。

　　細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細(xì)胞的活力。凍存細(xì)胞不加任何保護(hù)劑，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。

　　4、注意事項(xiàng)

　　(1)預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱;

　　(2)用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射的超凈工作臺(tái)和雙手;

　　(3)正確擺放使用的器械：足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染;

　　(4)點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小;

　　(5)嚴(yán)格的無(wú)菌操作;

　　(6)貼壁細(xì)胞消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化;

　　(7)傳代細(xì)胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每種細(xì)胞使用一套器材。避免交叉感染;

　　(8)傳代細(xì)胞瓶口每次打開(kāi)或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

　　實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)板步驟，我司由具有行業(yè)背景和豐富市場(chǎng)經(jīng)驗(yàn)的業(yè)人士組成，于為生命科學(xué)研究域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。   既能滿(mǎn)足研發(fā)類(lèi)客戶(hù)對(duì)產(chǎn)品種類(lèi)、包裝的特殊要求，也能滿(mǎn)足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。