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  hdpslin02 2016-12-01 22:45:03

  “當(dāng)某一不明病因的流行病侵襲人類時(shí)，人們對(duì)它的反應(yīng)顯示了人類對(duì)未知事物的恐 懼”（The terror of the unknown is seldom better displayed than by the response of an epidemic，particularly when the epidemic strikes without apparent cause）[1]。1977 年愛(ài)德華•凱斯曾用這句話來(lái)描述當(dāng)時(shí)公眾對(duì)新出現(xiàn)的軍團(tuán)病的恐慌心理，現(xiàn)在我們同樣面臨著一場(chǎng)不明病原體的新型非典型肺炎—嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征（SARS），這句話似乎同樣適用于對(duì)當(dāng)前人們心理的描述。不可否認(rèn)，一部分公眾對(duì)這場(chǎng)新的流行疾病存在恐慌心理，這種恐慌部分原因是出于對(duì)新疾病的不完全了解，對(duì)于這種疾病的病原體、傳播方式、致病機(jī)理、發(fā)病經(jīng)過(guò)、診斷ZL預(yù)防等仍然缺乏進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。不過(guò)，幸運(yùn)的是人類采取了積極的應(yīng)對(duì)措施，WHO組織國(guó)際實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合展開(kāi)對(duì)SARS 的研究，相關(guān)研究機(jī)構(gòu)在不到兩個(gè)月時(shí)間內(nèi)即找到了病原體并破譯了其基因組序列，初步揭開(kāi)了SARS 的神秘面紗。目前，專家們已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)SARS 疾病同一種新型冠狀病毒有關(guān)，而這種新病毒以前沒(méi)有在人體或動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過(guò)，這一發(fā)現(xiàn)為下一步的工作奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，專家將繼續(xù)揭開(kāi)這種疾病的更多的未知之處。研究人員通過(guò)性的協(xié)作，借助于互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和多種研究手段，在短短兩個(gè)月時(shí)間內(nèi)就鑒定出病原體。而在20 多年前，研究人員尋找HIV 病毒時(shí)用了兩年多時(shí)間，隨后又花費(fèi)幾年時(shí)間才獲得其核苷酸序列。與之相比，對(duì)尋找SARS 病原體的快速反應(yīng)令人印象深刻。如果我們大致回顧發(fā)現(xiàn)病原體的過(guò)程，或許可以得到新的經(jīng)驗(yàn)，為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ)，為未來(lái)可能爆發(fā)的另一場(chǎng)流行病提供經(jīng)驗(yàn)。 研究進(jìn)展 1.1 SARS 病原體的確認(rèn) 2003 年3 月15 日，WHO 組織國(guó)際研究網(wǎng)絡(luò)，相繼有11 個(gè)國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室參加，我國(guó)于 4 月初加入。研究網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)展過(guò)程大致如下。 3 月18 日，德國(guó)通過(guò)電鏡從咽拭子標(biāo)本中觀察到副粘病毒，同時(shí)香港中文大學(xué)獲得副粘病毒的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，并在網(wǎng)絡(luò)上公布電鏡圖片和基因序列。 3 月19 日，新加坡從病人呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)副粘病毒顆粒并獲得較微弱的病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物（根據(jù)香港中文大學(xué)提供的引物）。國(guó)際上首先發(fā)現(xiàn)副粘病毒的荷蘭鹿特丹實(shí)驗(yàn)室獲得有關(guān)病人的標(biāo)本。 3 月20 日，國(guó)際上有4 個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始進(jìn)行副粘病毒檢測(cè)。荷蘭鹿特丹實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到副粘病毒，但是副粘病毒基因擴(kuò)增為陰性，該實(shí)驗(yàn)室將檢測(cè)試劑送到新加坡和香港，加拿大實(shí)驗(yàn)室將雙份血清送到鹿特丹。 3 月21 日，香港中文大學(xué)科學(xué)家用猴腎細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得病毒分離物，隨即研制了相應(yīng)血清學(xué)診斷試劑。許多家實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示此次病原體與下列病原體無(wú)關(guān)：甲、乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1、2、3 型，腺病毒，鼻病毒，腸道病毒，人間質(zhì)肺炎病毒，肺炎支原體，肺炎衣原體；同時(shí)電鏡觀察到病毒顆粒為50-60nm，血清實(shí)驗(yàn)證明加入病人血清可以YZ細(xì)胞病變而對(duì)照血清無(wú)效。 3 月21 日，鹿特丹實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在德國(guó)的3 個(gè)新加坡病人呼吸道標(biāo)本的HMPV 病毒PCR 檢測(cè)為陰性。并且，兩個(gè)可疑病例的呼吸道標(biāo)本接種Vero 細(xì)胞和猴腎細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)病變。也是在這一天，英國(guó)科學(xué)家檢測(cè)該兩病人標(biāo)本中的H3N2 流感病毒；ZG病毒專家洪濤宣布衣原體是引起SARS 的主要病原體，但不排除衣原體和冠狀病毒同時(shí)作用。 3 月21 日，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所祝慶余、秦鄂德研究員等通過(guò)多方面的研究，成功從SARS 患者尸解標(biāo)本中分離出冠狀病毒樣病毒，推斷可能是SARS 的病原體，并將這一重要結(jié)果向解放軍總后勤部衛(wèi)生部和國(guó)家衛(wèi)生部進(jìn)行了書面匯報(bào)。 3 月22 日，香港病毒實(shí)驗(yàn)室電鏡發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒（70nm），美國(guó)從泰國(guó)病人標(biāo)本得到的細(xì)胞病變產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒（70-100nm），但同一份標(biāo)本獲得HMPV 病毒PCR陽(yáng)性結(jié)果。與此同時(shí)，加拿大、法國(guó)、新加坡等地開(kāi)始使用PCR 和電鏡方法檢測(cè)副粘病毒和HMPV 病毒。加拿大發(fā)現(xiàn)20nm 的病毒顆粒并且發(fā)布HMPV 病毒的基因進(jìn)化樹(shù)。 3 月23 日，香港病毒實(shí)驗(yàn)室在8 份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)2 份冠狀病毒RNA 陽(yáng)性。美國(guó)報(bào)道在香 港標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)冠狀病毒，同時(shí)建立免疫熒光檢測(cè)病人血清的方法，并將冠狀病毒的基因擴(kuò)增引物在網(wǎng)絡(luò)上公布。在新加坡和香港開(kāi)始用鼻咽拭子樣本感染支氣管的方式進(jìn)行靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。加拿大和法國(guó)分別以電鏡觀察和PCR 技術(shù)檢測(cè)到冠狀病毒。德國(guó)、日本、新加坡從Vero 細(xì)胞中分離到病毒。英國(guó)實(shí)驗(yàn)室在可疑病例呼吸道和尿標(biāo)本中檢測(cè)到雞肺炎病毒序列。 3 月24-26 日，德國(guó)、香港的實(shí)驗(yàn)室分別以電鏡觀察和PCR 技術(shù)檢測(cè)到冠狀病毒，德國(guó) 實(shí)驗(yàn)室獲得病毒序列，證實(shí)新病毒的氨基酸序列與已知冠狀病毒的多聚酶氨基酸序列相符，德國(guó)、荷蘭、香港等地實(shí)驗(yàn)室獲得更多的基因擴(kuò)增序列，并在網(wǎng)絡(luò)上公布新病毒的基因進(jìn)化樹(shù)。 3 月27-31 日，繼續(xù)進(jìn)行以猴子為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。香港和美國(guó)實(shí)驗(yàn)室分別證實(shí)正 常人血清與新分離病毒為陰性反應(yīng)。與此同時(shí)，有更多的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到冠狀病毒：日本從新加坡標(biāo)本中獲得陽(yáng)性結(jié)果；香港檢測(cè)了50 份病人血清，其中27 份冠狀病毒抗體升高，同時(shí)人們還從10 份病人糞便樣本中發(fā)現(xiàn)5 份為病毒檢測(cè)陽(yáng)性，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)病后6-16 天病人糞便中可以檢測(cè)到病毒基因；加拿大在病人標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)人類副粘病毒。 4 月1-8 日，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用副粘病毒和間質(zhì)肺炎病毒共同感染的猴子出現(xiàn)臨床癥狀。 美國(guó)研究人員用ELISA 方法從發(fā)病20 天的病人血中檢測(cè)到抗體。香港研究人員用免疫熒光方法從發(fā)病10 天的病人血清中檢測(cè)到IgM 抗體。小白鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始啟動(dòng)。更多實(shí)驗(yàn)室在Vero培養(yǎng)細(xì)胞中分離到冠狀病毒，又有一些血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SARS 疾病為副粘病毒和冠狀病毒復(fù)合感染。荷蘭、德國(guó)、香港和美國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的新序列，德國(guó)科學(xué)家在標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)衣原體。 4 月9 日，ZG疾病預(yù)防控制ZX和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所在軍事醫(yī)學(xué)科 學(xué)院舉行了有關(guān)SARS 病原體研究座談會(huì)，雙方有關(guān)專家分別介紹了衣原體和冠狀病毒方面的研究進(jìn)展。 4 月10 日下午，病毒學(xué)專家、ZG工程院院士洪濤在舉行的“非典型肺炎FZ知識(shí)介紹會(huì)”上向中外數(shù)十家媒體宣布：“對(duì)非典型肺炎病原體的研究目前初見(jiàn)成效，已找到兩種主要病原體--衣原體和冠狀病毒樣病毒”。 4 月10 日，據(jù)新華社報(bào)道，ZG疾病預(yù)防控制ZX病毒病預(yù)防控制所李德新教授、畢勝利教授、段淑敏主任和許文波教授等科技人員，在非典型肺炎的病原學(xué)研究上取得重大突破，成功分離到數(shù)株冠狀病毒，克隆了所分離到的冠狀病毒部分基因。他們?cè)谌烙诜堑湫头窝撞∪说姆螛?biāo)本和其中一例的脾標(biāo)本進(jìn)行了冠狀病毒檢測(cè)，并從這些標(biāo)本中提純并擴(kuò)增出冠狀病毒基因，經(jīng)過(guò)核苷酸序列測(cè)定證實(shí)所擴(kuò)增基因?yàn)楣跔畈《镜腞NA 聚合酶基因，從而在世界上首次用分子生物學(xué)手段證實(shí)了病人器官內(nèi)存在冠狀病毒。他們把新病毒和其他冠狀病毒的基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)存在于非典型肺炎病人體內(nèi)的冠狀病毒為一種變異冠狀病毒。用這些標(biāo)本進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)，成功分離到新冠狀病毒，病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中數(shù)次傳代，均穩(wěn)定出現(xiàn)細(xì)胞病變，對(duì)該病毒的基因檢測(cè)持續(xù)陽(yáng)性。從國(guó)內(nèi)非典型肺炎病人咽拭子中分離到三株冠狀病毒，這些病毒的核苷酸序列和從病人臟器中分離到的冠狀病毒核苷酸序列相同。目前獲得的研究結(jié)果，在很大程度上表明冠狀病毒可能是引起非典型肺炎的病原體。 4 月11 日，新華社公布了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所祝慶余、秦鄂德兩位研究員的發(fā)現(xiàn)。2 月底，該研究所從一例SARS 患者尸解標(biāo)本中分離并辨認(rèn)出冠狀病毒。截止到3 月21 日，通過(guò)血清學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究，獲得了關(guān)于冠狀病毒的進(jìn)一步證明。4 月9 日，對(duì)分離出的4 株冠狀病毒進(jìn)行了序列測(cè)定。4 月16 日公布了這些結(jié)果。 4 月12 日，加拿大溫哥華不列顛哥倫比亞癌癥研究所Holt 博士及其研究組公布了SARS 嫌疑病原體的基因組序列。 4 月14 日，美國(guó)亞特蘭大CDC 的Anderson 博士研究小組也完成了基因組測(cè)序并在網(wǎng)上 公布，兩個(gè)研究小組的測(cè)序結(jié)果基本一致。 4 月16 日，WHO 負(fù)責(zé)傳染病的執(zhí)行干事戴維•海曼宣布，經(jīng)過(guò)科研人員通力合作，正式確認(rèn)一種變異冠狀病毒引起SARS。 4 月17 日，WHO 在日內(nèi)瓦召開(kāi)的新聞發(fā)布會(huì)宣布：完成病原體確定的Z后一步工作， 即“科赫推定”中的第四步。由荷蘭Erasmus 大學(xué)Albert Osterhaus 博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組成功地用新冠狀病毒使實(shí)驗(yàn)用猴子染病，進(jìn)而該研究小組從被感染猴子體內(nèi)分離出該病毒并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。表明科學(xué)家在一個(gè)月的通力合作后，初步確定了SARS 的病原體[2-9]。 4 月22 日，ZG公布“非典”元兇冠狀病毒圖[3][7][10] 。 1.2 SARS 病毒基因組解碼進(jìn)展 1.2.1 加拿大史密斯基因科學(xué)ZX 4 月12 日，加拿大科學(xué)家破解SARS 疑似病原體的基因，朝開(kāi)發(fā)SARS 診斷方法以及研 發(fā)SARS 疫苗、藥物邁出diyi步。 位于溫哥華的史密斯基因科學(xué)ZX投入對(duì)抗SARS 的行列。ZX主任馬拉說(shuō)，基因 編碼是科學(xué)家研發(fā)診斷檢驗(yàn)方法所需的基本資料。史密斯基因科學(xué)ZX破解此基因編碼之后，立即在國(guó)際網(wǎng)絡(luò)上公布（http://www.bcgsc.bc.ca）以提供給世界各地其它科學(xué)家使用。 1.2.2 香港大學(xué) 港大微生物學(xué)系主任袁國(guó)勇表示，港大醫(yī)學(xué)院完成引發(fā)SARS的冠狀病毒基因序列測(cè)定，確定是一種全新病毒，懷疑是由動(dòng)物傳播到人，至于是什么動(dòng)物，則有待研究。袁國(guó)勇認(rèn)為，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)有助于改善目前的快速測(cè)試方法。此前，香港中文大學(xué)的研究人員已于13 日晚將他們破解的新型冠狀病毒部分基因序列交給世界衛(wèi)生組織的“SARS”工作小組。 1.2.3 美國(guó)疾病預(yù)防控制ZX 美國(guó)疾病預(yù)防控制ZX4 月14 日宣稱，已經(jīng)完成了對(duì)被認(rèn)為是引起SARS 流行的 新冠狀病毒基因組的測(cè)序。其基因測(cè)序結(jié)果與加拿大一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)序結(jié)果基本一樣。對(duì)兩家機(jī)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果比較后，發(fā)現(xiàn)其中的區(qū)別在于他們的測(cè)序結(jié)果有15 個(gè)額外的核苷酸，而這將是繼續(xù)開(kāi)展測(cè)序工作的重大開(kāi)端。測(cè)序結(jié)果是在10 名科學(xué)家及許多技術(shù)人員的共同努力下，工作了12 天后得出的。研究人員將其中一例SARS 患者的咽喉分泌物，在非洲綠猴腎細(xì)胞中進(jìn)行傳代細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)引起該疾病的冠狀病毒的核酸序列提純后擴(kuò)增測(cè)序。新的基因序列共有29，727 個(gè)核苷，在典型的冠狀病毒家族核糖核酸界值之內(nèi)，冠狀病毒家族成員一般有29，000 至31，000 個(gè)核苷。美國(guó)疾病預(yù)防控制ZX主任Julie Gerberding 博士談到，確定一種新型病毒的基因序列對(duì)于疾病的ZL和預(yù)防都是十分重要的。利用有關(guān)基因序列的信息，可以開(kāi)始進(jìn)行有關(guān)抗病物的實(shí)驗(yàn)室研究工作，可以作為研制疫苗的基礎(chǔ)，也可以發(fā)展診斷性測(cè)試以便早期發(fā)現(xiàn)病例。美國(guó)和加拿大的研究結(jié)果幾乎相同，這一點(diǎn)十分重要，表明病毒可能有共同的來(lái)源，因?yàn)檫@些樣品是從在不同國(guó)家受到感染的不同的個(gè)體中采集的。但美國(guó)疾病預(yù)防控制ZX的官員強(qiáng)調(diào)，對(duì)于病毒的分析工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有完成，冠狀病毒能夠 快速變異，研究人員需要將由細(xì)胞培養(yǎng)分離到的病毒與從SARS 患者的患病組織中所獲得的病毒加以比較，所開(kāi)展的基因測(cè)序工作將會(huì)加快比較工作的進(jìn)行。 1.2.4 ZG科學(xué)院北京基因組研究所與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 ZG科學(xué)院北京基因組研究所與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所通力合作，于2003年4 月16 日完成了對(duì)分離自不同SARS 病例的四株冠狀病毒的基因組解碼工作。結(jié)果顯示，這一病毒的長(zhǎng)度約為3 萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，與加拿大、美國(guó)報(bào)告的序列基本一致，屬于一種新型冠狀病毒，這一成果僅比加拿大科學(xué)家宣布破譯冠狀病毒基因的時(shí)間晚兩天。冠狀病毒全基因組序列的成功測(cè)定，為追蹤冠狀病毒的來(lái)源，研制非典型性肺炎的診斷制劑、疫苗和ZL藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使我國(guó)的非典型肺炎FZ工作向前邁出重要一步[2][3][4][5][8][10]。 2 研究人員分離并鑒定病原體 在這場(chǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合尋找病原體的行動(dòng)中，香港研究人員率先取得了突破，他們以傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及現(xiàn)代分子遺傳學(xué)方法，鑒定了50 例SARS 患者體內(nèi)的病原體—一種新冠狀病毒。另外，對(duì)對(duì)照組樣本的分析進(jìn)一步支持了他們關(guān)于病原體的論點(diǎn)：在40 例來(lái)自患有其它呼吸疾病患者的呼吸道樣本中，沒(méi)有檢測(cè)到一份樣本含有新冠狀病毒的RNA；對(duì)來(lái)自血液捐獻(xiàn)者的200 份血清樣本中，沒(méi)有一份含有這種病毒的抗體。 這些發(fā)現(xiàn)同時(shí)支持了另兩家研究機(jī)構(gòu)所提出的觀點(diǎn)，美國(guó)疾病控制和預(yù)防ZX（CDC）和加拿大多倫多的相關(guān)研究機(jī)構(gòu)同樣在SARS 患者體內(nèi)分離到了這種新型冠狀病毒，并認(rèn)為該病毒與SARS 爆發(fā)有聯(lián)系。德國(guó)研究人員在Z初的三例患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒，并且進(jìn)一步收集了來(lái)自越南河內(nèi)的患者樣本進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果也支持該結(jié)論。 2.1 國(guó)際實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)的研究結(jié)果 2.1.1 ZG香港 香港大學(xué)微生物學(xué)系教授Peiris 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組對(duì)香港的患者進(jìn)行了研究以尋找病原 體。 該小組選擇了香港三家急救醫(yī)院收治的50 例符合WHO 修改定義的SARS 患者，收集 了所有患者的咽拭樣本和血清樣本，選擇了部分患者分別收集嚴(yán)重期和康復(fù)期的血清和排泄 物樣本。另外，他們?nèi)〉靡焕颊叻谓M織樣本，進(jìn)行了病毒培養(yǎng)分離、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 、常規(guī)的組織放射自顯影和電鏡觀察。用其他病人的咽拭樣本、排泄物和血清樣本的微生物 檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照。 研究人員Z初進(jìn)行了常規(guī)的血液檢查、生化檢查以及微生物檢查，對(duì)血液樣本、咽拭樣 本分別進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，對(duì)咽拭樣本進(jìn)行快速熒光抗原檢測(cè)，以確定病原體是 否為常見(jiàn)呼吸道感染病毒，并且用多種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以分離病原體；用臨床樣本直接進(jìn)行 RT-PCR，以檢測(cè)是否為A 型流感病毒和人副粘病毒感染。另外，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞采用了ELISA 方法以檢測(cè)是否存在衣原體。 研究的突破在于從兩名患者的樣本中分別觀察到了冠狀病毒樣顆粒。樣本之一來(lái)源于一 名53 歲男性患者，在他的咽拭樣本、肺活組織切片等樣本中檢測(cè)到冠狀病毒RNA，患者本 身冠狀病毒抗體滴度顯著升高（1/200~1/1600）。另一樣本取自一名42 歲女性患者，PCR 檢 測(cè)對(duì)冠狀病毒呈陽(yáng)性，她本身的血清抗體有變化（1/150~1/1600）。 研究人員分別對(duì)兩個(gè)樣本進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞接種，2-4 天后出現(xiàn)圓形折光的病變細(xì)胞，表明 有病原體分離，分離到的病原體不和識(shí)別常見(jiàn)病毒的試劑板反應(yīng)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的提出物進(jìn)行 42 高速離心，隨即進(jìn)行了電鏡負(fù)染色觀察，發(fā)現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的包膜病毒，直徑約80-90nm，表 面特征與冠狀病毒相似。對(duì)被感染細(xì)胞超薄切片進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面均 存在類似病毒顆粒，并且從兩名患者體內(nèi)分離出的病毒大小和形態(tài)特征很相似。 為獲得新分離病毒的基因序列信息，研究人員進(jìn)行了隨機(jī)RT-PCR，克隆測(cè)序了病毒感 染細(xì)胞的特征染色體帶，在GenBank 中進(jìn)行了同源序列比較，在被檢測(cè)的30 個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn) 了一個(gè)未知序列。對(duì)這段DNA 序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與冠狀病毒存在低同源性，但由其推出 的氨基酸序列與冠狀病毒科的牛冠狀病毒和鼠肺炎病毒RNA 聚合酶存在高同源性（57%）， 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究顯示新病毒與冠狀病毒Group2 高度相關(guān)。對(duì)病毒血清學(xué)反應(yīng)采 用了間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示在32 例患者嚴(yán)重期和康復(fù)期的血清對(duì)比中，均出現(xiàn)血清 轉(zhuǎn)化，存在冠狀病毒的抗體滴度增長(zhǎng)的現(xiàn)象。 研究小組還對(duì)人副粘病毒進(jìn)行了RT-PCR 和血清抗體滴度檢測(cè)，結(jié)果顯示陰性，也未 檢測(cè)到其它病原體。因此，研究小組認(rèn)為分離到的冠狀病毒就是SARS 的病原體或一個(gè)必需 的因子，不過(guò)，是否有其它的微生物或非微生物輔助因子起作用，則有待觀察[11][12]。 2.1.2 德國(guó) Z初SARS 爆發(fā)于亞洲，由于洲際旅行該疾病從亞洲傳播到其它大洲。鑒于SARS 疾病 是一種新出現(xiàn)的病癥，人類對(duì)其病原體一無(wú)所知，Z初的研究工作集中于對(duì)病原體的鑒定。 WHO 組織了國(guó)際實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，集中各有關(guān)國(guó)家的研究力量以找出SARS 的病原體。德國(guó)研 究機(jī)構(gòu)作為該網(wǎng)絡(luò)的一份子，也對(duì)病原體的鑒定展開(kāi)了研究。 該研究小組Z初選擇的樣本來(lái)自于同一家庭中的三個(gè)人：一名32 歲的男性患者、他的 妻子以及他的岳母。該男性為新加坡一名內(nèi)科醫(yī)生，曾ZL過(guò)一名SARS 患者而被感染，繼 而他感染了他的妻子和岳母。三人因故由新加坡到美國(guó)，該醫(yī)生在美國(guó)期間出現(xiàn)癥狀，他告 知了他的新加坡同事，該同事向WHO 作了匯報(bào)，WHO 在三人返回新加坡的航班中轉(zhuǎn)站— 法蘭克福對(duì)他們進(jìn)行隔離。德國(guó)相關(guān)研究人員取得了他們的呼吸道樣本和血液樣本，隨后該 小組還獲得了來(lái)自亞洲的其他18 名可疑或可能SARS 病例的樣本，以及21 名接觸過(guò)SARS 患者但未被感染人員的樣本。 研究人員首先對(duì)上述3 例患者的樣本進(jìn)行了PCR 檢測(cè)，以鑒定是否存在肺炎雙球菌、 肺炎衣原體、人巨細(xì)胞病毒、副流感病毒、流感病毒、人副粘病毒、鼻病毒及人冠狀病毒 OC43 和229E 型等已知呼吸道病原體；對(duì)呼吸道樣本進(jìn)行抗原ELISA，以檢測(cè)是否存在肺 炎球菌、流感病毒及呼吸道合胞病毒，同時(shí)對(duì)血液樣本進(jìn)行了血清學(xué)檢測(cè)；另外，研究人員 對(duì)呼吸道樣本和血液樣本負(fù)染以進(jìn)行電鏡觀察，并將樣本進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞接種。 研究人員用痰液樣本進(jìn)行了RNA 抽提，以隨機(jī)RT-PCR 技術(shù)分析，所設(shè)計(jì)的一些PCR 引物含有簡(jiǎn)并性位點(diǎn)，并且多數(shù)引物3’端為T 堿基，以便DNA 多聚酶在引物末端堿基不 完全匹配的情況下能夠生效。使用了BLAST 工具對(duì)克隆擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行了同源性比較。 研究小組通過(guò)對(duì)三例患者的樣本進(jìn)行的多次檢測(cè)，針對(duì)已知呼吸道病原體的檢測(cè)結(jié)果 多為陰性，電鏡觀察呼吸道樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)了稀少的副粘病毒樣顆粒，但隨后的數(shù)次針對(duì)副粘病 毒家族的PCR 檢測(cè)均顯示陰性。痰液樣本接種培養(yǎng)細(xì)胞6 天后，研究人員發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中存 在病變細(xì)胞，隨即進(jìn)行了RNA 抽提，對(duì)提取的RNA 進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增克隆出約20 個(gè)不 同的DNA 片段，對(duì)這些片段測(cè)序后以BLAST 進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)三個(gè)新的片段，新片段不與 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列匹配，但由新片段推出的氨基酸序列顯示了與冠狀病毒家族的同源性，表明 分離了一種新冠狀病毒。研究人員將新片段與美國(guó)疾病預(yù)防和控制ZX（CDC）所測(cè)得的新 病毒核酸序列進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)存在同源性。在對(duì)這三例患者的血清樣本以及被感染的培養(yǎng) 細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)，以確定是否存在抗體。在兩名患者的血清中檢測(cè)到IgG 抗體升高， 表明存在新冠狀病毒的血清反應(yīng)。 43 為檢驗(yàn)新病毒是否同SARS 相聯(lián)系，研究人員進(jìn)一步收集了來(lái)自可能或可疑SARS 患者 及同SARS 患者有過(guò)接觸但未被感染人員的樣本（進(jìn)一步收集的樣本均來(lái)自越南河內(nèi)），對(duì) 這一批樣本進(jìn)行了巢式PCR 分析，結(jié)果在可能SARS 病例中發(fā)現(xiàn)病毒的比例是，在可 疑病例中是23%，但在健康接觸者中未發(fā)現(xiàn)病毒，這些數(shù)據(jù)或許可進(jìn)一步證明新冠狀病毒和 SARS 的聯(lián)系。 該研究小組還曾檢測(cè)到副粘病毒及肺炎球菌，但隨后的針對(duì)性PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。在 幾例患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了衣原體感染，但并沒(méi)有在其他SARS 患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。因此研究人員還不 清楚這些病原體在SARS 疾病中是作為致病因子還是聯(lián)合致病因子[13]。 2.1.3 美國(guó) 美國(guó)疾病預(yù)防控制ZX（CDC）是WHO 所組織的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)的研究機(jī)構(gòu)之一，他 們也展開(kāi)了對(duì)SARS 病原體的鑒定工作。CDC 的樣本來(lái)自于越南、新加坡、泰國(guó)、加拿大 、ZG香港、臺(tái)灣和美國(guó)等的SARS 患者，試圖從一系列已知的病原體中鑒定出引起此次 SARS 爆發(fā)的病源。 由于SARS 患者的臨床癥狀沒(méi)有特異性，Z初的研究側(cè)重于對(duì)已知的呼吸道病原體的排 查，綜合使用了多種檢測(cè)方法。研究人員收集了包括血液、血清、鼻咽拭子、含嗽液和器官 組織在內(nèi)的多種樣本，在多種細(xì)胞中進(jìn)行了培養(yǎng)，并對(duì)乳鼠進(jìn)行了注射接種，以分離病原體； 觀察培養(yǎng)細(xì)胞和乳鼠，對(duì)出現(xiàn)病變的細(xì)胞或個(gè)體制備切片以進(jìn)行電鏡觀察；對(duì)血清樣本進(jìn)行 了血清學(xué)實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)抗體；進(jìn)行了一般的和特殊的細(xì)菌培養(yǎng)，還利用了分子生物技術(shù)如PCR 、RT-PCR；對(duì)多種呼吸道病原體進(jìn)行了篩選，如耶爾森氏菌、支原體、衣原體、立克次體 、軍團(tuán)桿菌、流感病毒A、B 型，副流感病毒家族等。 研究的突破在于通過(guò)電鏡觀察到了冠狀病毒樣顆粒。以患者呼吸道樣本接種的培養(yǎng)細(xì) 胞出現(xiàn)了細(xì)胞病變，對(duì)出現(xiàn)病變的細(xì)胞制作超薄切片，進(jìn)行電鏡觀察，在病變細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞 膜發(fā)現(xiàn)了冠狀病毒樣顆粒：直徑約80-140nm，病毒表面有20-40nm 結(jié)構(gòu)復(fù)雜的突出物。利 用電鏡觀察患者支氣管沖洗液樣本，同樣發(fā)現(xiàn)了許多被感染細(xì)胞均存在冠狀病毒。 研究人員對(duì)病變細(xì)胞進(jìn)行了RNA抽提和RT-PCR 以擴(kuò)增新病毒序列，引物根據(jù)GenBank 中的已知冠狀病毒的序列信息而設(shè)計(jì)。對(duì)擴(kuò)增后的純化產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序分析，與已公布的冠 狀病毒序列進(jìn)行了比對(duì)，并利用生物信息學(xué)技術(shù)分析，得出該病毒的進(jìn)化樹(shù)。新病毒與其他 冠狀病毒的序列以及由序列推出的氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新病毒與冠狀病毒家族group2 有較高的同源性。但分析進(jìn)化樹(shù)顯示，這種病毒在遺傳學(xué)上與其它冠狀病毒均有不同，表明 分離的是一種新型冠狀病毒。對(duì)樣本進(jìn)行的血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以感染細(xì)胞切片與處于恢復(fù)期 的SARS 疑似患者血清進(jìn)行反應(yīng)，來(lái)自香港、曼谷和美國(guó)的SARS 疑似患者血清呈特異性反 應(yīng)，呈現(xiàn)從陰性到陽(yáng)性轉(zhuǎn)變或在間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)性；對(duì)同一批血清樣本進(jìn)行 ELISA 抗原檢驗(yàn)，恢復(fù)期樣本的的反應(yīng)呈高特異性，抗體滴度也逐漸升高。 經(jīng)過(guò)樣本接種培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增病原體，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病原體為冠狀病毒屬，分子生物學(xué)研 究進(jìn)一步確定新病毒的本質(zhì)特征，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定了與疾病的聯(lián)系，因此研究人員認(rèn)為分離 到的新型冠狀病毒有可能是SARS 的病原體。不過(guò)該研究小組同時(shí)指出：患者病灶組織細(xì)胞 中新冠狀病毒抗原或病毒RNA 還未在病理過(guò)程中被直接檢測(cè)到。同時(shí)，還不能證實(shí)新病毒 存在于所有SARS 患者體內(nèi)，一些SARS 患者未檢出冠狀病毒，需要進(jìn)一步的相關(guān)研究[14][15]。 2.1.4 加拿大 加拿大國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室以及相關(guān)研究機(jī)構(gòu)組織了SARS 研究小組，展開(kāi)了對(duì)SARS 疾病的研究。 研究人員經(jīng)過(guò)追蹤調(diào)查，證實(shí)該國(guó)Z初的SARS 患者曾經(jīng)去過(guò)香港并在那里被感染， 44 該患者返回加拿大并且將SARS 疾病傳播到該國(guó)。研究人員所取得的樣本即來(lái)自該患者（已 死亡）直接或間接傳染的9 名患者。研究人員對(duì)1 例尸檢組織樣本進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查， 對(duì)全部9 例患者的樣本進(jìn)行了微生物學(xué)檢測(cè)。對(duì)尸檢組織樣本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)，以 檢測(cè)是否存在流感病毒A、B，呼吸道合胞病毒、腺病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、腸病毒、 黃病毒等已知常見(jiàn)病毒，以及立克次體、肺炎支原體、肺炎衣原體、耶爾森氏菌等，所有檢 測(cè)結(jié)果均為陰性。對(duì)9 例患者的血液樣本、呼吸道樣本以及尿液樣本進(jìn)行了常規(guī)的細(xì)菌和真 菌檢測(cè)，并對(duì)這些樣本進(jìn)行了培養(yǎng)，結(jié)果顯示陰性，另外針對(duì)軍團(tuán)菌的專門檢測(cè)亦顯示陰性。 研究人員對(duì)呼吸道樣本進(jìn)行了常見(jiàn)細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)，抽提了DNA，進(jìn)行了針對(duì)常見(jiàn) 肺炎菌，耶爾森氏菌及衣原體等微生物的RT-PCR，結(jié)果同樣顯示陰性。 研究人員還進(jìn)行了常見(jiàn)病毒的檢測(cè)，對(duì)9 例患者的所有呼吸道樣本和糞便樣本進(jìn)行了常 規(guī)的直接病毒檢測(cè)，包括電鏡觀察和直接熒光抗體檢測(cè)，沒(méi)有在樣本中發(fā)現(xiàn)流感病毒A、B， 副流感病毒1、2、3，腺病毒、呼吸道合胞病毒等。同樣，針對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒，研究人員 也進(jìn)行了病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)，大多數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示陰性，但對(duì)支氣管沖洗液樣本以及 咽拭樣本進(jìn)行的巢式RT-PCR 發(fā)現(xiàn)了人副粘液病毒，并且排除了實(shí)驗(yàn)室交叉感染的可能性。 另外，從以呼吸道樣本接種的培養(yǎng)細(xì)胞中分離了一種新型冠狀病毒，在9 例SARS 患者中5 例患者的樣本分離出了這種病毒，在4 例患者的樣本中分離到了副粘液病毒。至此，該研究 機(jī)構(gòu)、香港研究小組和美國(guó)CDC 研究人員均報(bào)道了在SARS 患者體內(nèi)分離到了新型冠狀病 毒。研究人員隨后對(duì)新病毒進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增克隆了病毒的核苷酸序列，并對(duì)其進(jìn)行了測(cè) 序，以生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了分析：新病毒的序列和已知冠狀病毒的序列均不同， 但是由該序列推出的氨基酸序列與已知幾種冠狀病毒的氨基酸序列有較高同源性（78%）， 新病毒的生物進(jìn)化樹(shù)分析顯示新病毒同已知的冠狀病毒家族（group1、group2 和group3）均 不十分接近。 基于已有的發(fā)現(xiàn)，研究人員得出結(jié)論，認(rèn)為所分離的人副粘病毒和新冠狀病毒可能都與 SARS 疾病相聯(lián)系，但還不清楚是兩者聯(lián)合作用，還是兩病毒分別單獨(dú)作用，甚或還有其它 未被檢測(cè)出的病毒在起作用，需要進(jìn)一步研究以證實(shí)[16]。 2.2 ZG ZG疾病預(yù)防控制ZX病毒預(yù)防控制所洪濤院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組就SARS 的病原體展 開(kāi)了研究，經(jīng)電鏡觀察到SARS 患者尸檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了衣原體和冠狀病毒顆粒，并在《中華 醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表了他們的研究文獻(xiàn)。 該研究小組選擇的樣本來(lái)自7 例因患SARS 死亡的患者，研究人員采集了死者的臟器 組織標(biāo)本，制作了電鏡標(biāo)本和病理標(biāo)本。7 名死者中4 例來(lái)自廣東，1 例來(lái)自山西，1 例來(lái) 自北京，1 例為死于成都的香港患者，具有一定代表性。為分離病原，將病人肺組織提取物 接種于293 細(xì)胞(人胚腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞系)，并且對(duì)病人組織及其分離的病原進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，采 取了間接免疫熒光和免疫組織化學(xué)

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