參與評(píng)論

評(píng)論

登錄后參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

• 

  我有權(quán)11啊 2017-05-09 00:00:00

  樓主好! 實(shí)驗(yàn)八 培養(yǎng)基的制備與滅菌 一、目的要求1. 掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法.2. 掌握培養(yǎng)基的配置方法.3. 掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法.二、基本原理 正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ).由于微生物種類及代謝類型的多樣性．因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異.但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同．例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同.三、實(shí)驗(yàn)材料1. 藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液.2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等.3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等.四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈.將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈.移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗.洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用.2．滅菌前玻璃器皿的包裝（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌.包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用.（2） 圖8-1 移液管的包扎移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中.塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約1~1.5cm.塞棉花時(shí)．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi).棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn).先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái).上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌.（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程1．液體培養(yǎng)基配制1) 稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量．然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量.2) 溶將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來(lái)水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解.3) 定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積.如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中.4) 調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH.用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié).調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分.邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止.5) 過(guò)濾：用濾紙或多層紗布過(guò)濾培養(yǎng)基.一般無(wú)特殊要求時(shí)，此步可省去.2．固體培養(yǎng)基的配制 配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦.繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，Z后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分.（三）培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染.如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去.1．試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾.分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開(kāi)放彈簧夾，中指及無(wú)名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi).裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中.用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜.2．三角瓶的分裝圖8-2培養(yǎng)基的分裝 用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化.（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過(guò)濾CJ.通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等.1．試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從ZY壓入團(tuán)孔中制成棉塞．然后直接壓入試管或三角瓶口.也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞.制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過(guò)緊或過(guò)松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn).棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外.目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上.將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙.用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用. 圖8-3 棉塞的制作圖8-4 正確與不正確的棉塞1.金屬塞 2正確 3、4不正確 2．三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上.有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上.在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用.（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌.（六）斜面和平板的制作1．斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面.斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度l／2為宜.如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固.2．平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50℃左右傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中.溫度過(guò)高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板.平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開(kāi)，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開(kāi)一縫，至瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板.（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無(wú)菌檢查.Z好取出1~2管(瓶)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)1~2天，確定無(wú)菌后方可使用.（八）無(wú)菌水的制備在每個(gè)250mL的三角瓶?jī)?nèi)裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞.在每支試管內(nèi)裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞.再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌.0.1MPa滅菌20~30min.五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿，并進(jìn)行包扎.2. 根據(jù)要求配制各種培養(yǎng)基.3. 用電熱鼓風(fēng)干燥箱對(duì)玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌.4. 用高壓蒸汽滅菌鍋對(duì)所配各培養(yǎng)基滅菌.六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 簡(jiǎn)述移液管和培養(yǎng)皿的包扎注意事項(xiàng).2. 簡(jiǎn)述配制培養(yǎng)基的基本步驟及注意事項(xiàng).3. 為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用報(bào)紙包起來(lái)，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后才能使用?4. 為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞（硅膠塞）才能使用?5. 配制培養(yǎng)基時(shí)為什么要調(diào)節(jié)pH?6. 高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時(shí)間短? 附錄 滅菌技術(shù)一、目的要求了解消毒和滅菌的原理，并掌握各種滅菌方法的操作步驟.二、實(shí)驗(yàn)材料1. 儀器或其他用具：上述包扎的培養(yǎng)皿、試管、移液管等，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，微孔濾膜過(guò)濾器，0.22μm濾膜，注射器，鑷子，玻璃涂棒.2. 培養(yǎng)基：上述配制的培養(yǎng)基及生理鹽水三、基本原理在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此必須對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所進(jìn)行滅菌和消毒.滅菌是指殺死一定環(huán)境中的所有微生物，包括微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子.實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法包括直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等方法.這些方法的基本原理是通過(guò)加熱使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的.四、操作步驟（一）干熱滅菌法干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160℃~170℃）進(jìn)行滅菌，它是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的.此法適用于玻璃器皿如移液管、試管和培養(yǎng)皿的滅菌.培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能采用干熱滅菌.細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢.因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160℃~170℃），時(shí)間長(zhǎng)（1~2h）.但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒.干熱滅菌使用的是電熱干燥箱（干燥箱）.具體操作步驟如下：1. 裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱干燥箱內(nèi)，關(guān)好箱門(mén).堆積時(shí)要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱干燥箱內(nèi)壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火.2. 升溫：接通電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，適當(dāng)打開(kāi)電熱干燥箱頂部的排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器，使溫度逐步上升.當(dāng)溫度升至100℃時(shí)，關(guān)閉排氣孔.在升溫過(guò)程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱干燥箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160℃~170℃，則需要轉(zhuǎn)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)器使紅燈亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需的溫度.3. 恒溫：當(dāng)溫度升到160℃~170℃時(shí)，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制，保持此溫度2h.干熱滅菌過(guò)程中，嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故.4. 降溫：切斷電源，自然降溫.5. 開(kāi)箱取物：待電熱干燥箱內(nèi)溫度降到60℃以下后，才能打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品.同時(shí)，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到零點(diǎn)，并打開(kāi)排氣孔.電熱干燥箱內(nèi)溫度未降到60℃以前，切勿自行打開(kāi)箱門(mén)，以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂.（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定的壓力下保持15~30分鐘進(jìn)行滅菌.此法適用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌.將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽.待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)，獲得高于100℃的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的.在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌.有三點(diǎn)原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)容易凝固變性，蛋白質(zhì)隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比干燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結(jié)，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力.實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結(jié)構(gòu)和工作原理是相同的.本實(shí)驗(yàn)介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說(shuō)明書(shū).具體操作步驟如下：1. 加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒(méi)過(guò)加熱蛇管，與三角擱架相平為宜.切勿忘記檢查水位，加水量過(guò)少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故.2. 裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品.注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果.裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞.3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開(kāi)排氣閥.4. 排氣：打開(kāi)電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出.一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘.5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開(kāi)始上升.6. 保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間.如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌.滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力.7. 降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開(kāi)排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水.壓力一定要降到“0”后，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物.否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者.8. 無(wú)菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，檢查無(wú)雜菌生長(zhǎng)后，即可使用. （三）過(guò)濾CJ有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等采用加熱滅菌法時(shí)，容易受熱分解而被破壞，因而要采用過(guò)濾CJ法.過(guò)濾CJ是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法，該方法Z大的優(yōu)點(diǎn)是不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分.過(guò)濾CJ法除實(shí)驗(yàn)室用于溶液、試劑的CJ外，在微生物工作中使用的凈化工作臺(tái)也是根據(jù)過(guò)濾CJ的原理設(shè)計(jì)的，可根據(jù)不同的需要來(lái)選用不同的濾器和濾板材料.應(yīng)用Z廣泛的過(guò)濾器種類有：1. 微孔濾膜過(guò)濾器：是一種新型過(guò)濾器，它由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質(zhì)通過(guò)濾膜，從而達(dá)到CJ的目的.其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），實(shí)驗(yàn)室中用于CJ的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm.根據(jù)待CJ溶液量的多少，可選用不同大小的濾器.該濾器的優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，過(guò)濾速度快，每張濾膜只使用1次，不用清洗.2. 蔡氏（Seitz）過(guò)濾器：是一種金屬制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu).溶液中的細(xì)菌通過(guò)石棉纖維的吸附和過(guò)濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大，每張纖維板只能使用1次.3. 玻璃過(guò)濾器：是一種玻璃制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造.玻璃濾器的規(guī)格很多，5號(hào)（孔徑2~5μm）和6號(hào)（孔徑

  贊(14)

  回復(fù)(0)

  評(píng)論

  評(píng)論

  登錄后參與評(píng)論