序言

上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 (Upconversion phosphors material,UPM) 是一類在長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)下發(fā)射短波長(zhǎng)光的材料， 其特點(diǎn)是所吸收的光子能量低于發(fā)射的光子能量。 由于使用紅外光作為激發(fā)光源， 此類材料在防偽標(biāo)記、 激光探測(cè)和立體顯示上的用途已經(jīng)廣為人知。 Z近幾年來(lái) , 科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料有不易發(fā)生光漂白和發(fā)光強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn) , 用在生物標(biāo)記中可以大大提高檢測(cè)靈敏度和線性范圍， 因此上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的熒光發(fā)射光譜是表征其性能的一個(gè)重要指標(biāo)， 具有非常重要意義。

與傳統(tǒng)典型的熒光發(fā)光過(guò)程（ 只涉及一個(gè)基態(tài)和一個(gè)激發(fā)態(tài)）不同， 上轉(zhuǎn)換過(guò)程需要許多中間態(tài)來(lái)累積低頻的激發(fā)光子的能量。 其中主要有三種發(fā)光機(jī)制： 激發(fā)態(tài)吸收、 能量轉(zhuǎn)換過(guò)程、 光子雪崩。 這些過(guò)程均是通過(guò)摻雜在晶體顆粒中的激活離子能級(jí)連續(xù)吸收一個(gè)或多個(gè)光子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而那些具有 f 電子和 d 電子的激活離子因具有大量的亞穩(wěn)能級(jí)而被用來(lái)上轉(zhuǎn)換發(fā)光。然而GX率的上轉(zhuǎn)換過(guò)程，只能靠摻雜三價(jià)稀土離子實(shí)現(xiàn)，因其有較長(zhǎng)的亞穩(wěn)能級(jí)壽命。稀土離子的吸收和發(fā)射光譜主要來(lái)自內(nèi)層 4f 電子的躍遷。 在外圍 5s 和 5p 的電子的屏蔽下，其 4f 電子幾乎不與基質(zhì)發(fā)生相互作用， 因此摻雜的稀土離子的吸收和發(fā)射光譜與其自由離子相似，顯示出極尖銳的峰（ 半峰寬約 10-20nm） 。而這同時(shí)就對(duì)外部激發(fā)光源的波長(zhǎng)有了很大的限制。激光熒光光譜技術(shù)用于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域具有信噪比高、靈敏度好、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于上轉(zhuǎn)換材料的發(fā)光檢測(cè)。商業(yè)化的 980nm 激光光源系統(tǒng)恰巧與它的吸收相匹配，為上轉(zhuǎn)換納米材料提供了理想的激光激發(fā)光源。

PerkinElmer 是世界上Z主要的熒光分光光度計(jì)生產(chǎn)商，也是技術(shù)上Zling先的高端儀器供應(yīng)商。PerkinElmer 公司是SJ采用脈沖氙燈做光源， 具有熒光、 磷光和化學(xué)發(fā)光三種測(cè)量模式， 在磷光和化學(xué)發(fā)光模式下， 儀器內(nèi)部激發(fā)光源自動(dòng)關(guān)閉， 這樣就為 980nm 激光光源的使用提供了便利的條件， 也為上轉(zhuǎn)換納米材料的熒光發(fā)光測(cè)試提供了硬件基礎(chǔ)， 而其它廠家大多數(shù)使用傳統(tǒng)的連續(xù)氙燈， 不能通過(guò)軟件將其關(guān)閉， 在使用激光光源時(shí)， 只能通過(guò)遮擋的方式將出光孔堵住； PerkinElmer 公司采用脈沖氙燈光源， 就可以很好的在內(nèi)部光源與外部激光光源之間進(jìn)行切換， 當(dāng)需要使用外部激光光源系統(tǒng)時(shí)，只需要通過(guò)軟件選擇激光測(cè)定模式即可， 不需要通過(guò)其它物理遮擋方式， 來(lái)遮擋儀器原有的激發(fā)光源， 這是PerkinElmer 公司優(yōu)于其它公司的重要技術(shù)之一。 這種操作不僅延長(zhǎng)了原有氙燈的使用壽命， 而且也很好的限制了由于物理遮擋導(dǎo)致的雜散光影響； 另外， 由于采用了靈活的可拆卸的樣品架套筒設(shè)計(jì)， 如圖 1 所示， 不僅固定了激光光源的輸出端， 使之與樣品池垂直， 保證激光光源能夠準(zhǔn)確的照射到待測(cè)樣品上而且， 在進(jìn)行常規(guī)熒光測(cè)定時(shí)， 容易取下， 大大簡(jiǎn)化了操作的繁瑣性。

硬件配置

主機(jī)： LS-55 型熒光分光光度計(jì) ( 圖 2)

附件： 激光光源及可拆卸樣品池套筒（圖 1）

圖 1. 激光光源及可拆卸樣品池架套筒

圖 2. PerkinElmerLS-55 熒光光譜儀

樣品測(cè)試

測(cè)試條件

測(cè)試模式： 激光測(cè)定模式

延遲時(shí)間： 0ms

掃描范圍： 300-700nm

掃描速度： 1000nm/min

測(cè)試結(jié)果

改變不同條件測(cè)試 UCNP 上轉(zhuǎn)換材料得到的熒光發(fā)射譜圖， 如下圖 3 所示。 從圖可以看出樣品在357nm、473nm、 645nm 有熒光發(fā)射峰， 這三個(gè)發(fā)射峰是 UCNP三個(gè)能級(jí)的光子發(fā)射， 其中在 473nm 處Z強(qiáng)， 且熒光發(fā)射峰窄且尖銳， 半峰寬大約 10nm， 測(cè)試結(jié)果令人滿意。

圖 3. 樣品熒光發(fā)射譜圖

結(jié)論

PerkinElmer 公司的 LS-55 熒光光譜儀連接激光做光源的熒光分析方法能夠準(zhǔn)確的測(cè)試上轉(zhuǎn)換材料的熒光發(fā)射峰，測(cè)試結(jié)果良好， 為上轉(zhuǎn)換材料的發(fā)光表征提供了wan美的解決方案。 該方法操作簡(jiǎn)單， 使用方便， 成本低廉， 能夠滿足絕大多數(shù)樣品的測(cè)試， 并且易于拆卸， 也能滿足常規(guī)樣品的測(cè)試， 是一個(gè)非常實(shí)用的解決方案。

       上轉(zhuǎn)換熒光材料是一類在長(zhǎng)波長(zhǎng)光激發(fā)下能產(chǎn)生短波長(zhǎng)光的發(fā)光材料，基于這個(gè)特點(diǎn)，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在生物熒光標(biāo)記、太陽(yáng)能電池、紅外光電探測(cè)、激光及顯示等眾多領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的激發(fā)光為紅外光，且生物組織的光透過(guò)窗口處于紅外波段，這意味著能夠有實(shí)現(xiàn)熒光探針體內(nèi)發(fā)光。另外稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料還具有發(fā)光靈敏性高，光穩(wěn)定性好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)。因此，稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料有望成為理想的具有應(yīng)用前景的生物熒光探針。

       NaYF4是目前公認(rèn)的上轉(zhuǎn)換效率較高的基質(zhì)材料，通過(guò)摻雜銩(Tm3+)、鉺(Er3+)或者其他稀土離子作為激活劑，鐿(Yb3+)作敏化劑，在980nm紅外光的激發(fā)下，利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程可實(shí)現(xiàn)可見光發(fā)射。通過(guò)控制納米材料的尺寸，并利用各種表面修飾劑對(duì)納米粒子的表面進(jìn)行適當(dāng)修飾，增強(qiáng)其生物兼容性，從而可以制備紅外光激發(fā)的生物熒光探針，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生物細(xì)胞、組織的熒光檢測(cè)與標(biāo)記。

一、上轉(zhuǎn)換熒光光譜
采用北京卓立漢光自主研發(fā)生產(chǎn)的OmniFluo“卓譜”熒光光譜測(cè)量系統(tǒng)測(cè)試NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換熒光光譜，激發(fā)光源選用980nm固體激光器，熒光光譜圖如1所示；圖2為Yb3+離子和Tm3+離子的能級(jí)躍遷圖以及NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制。

圖1  NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換熒光光譜

圖1為NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖，發(fā)射峰主要對(duì)應(yīng)于Tm3+：289 nm左右對(duì)用于1I6→3H6，354 nm左右對(duì)應(yīng)于1I6→3F4，361.5 nm左右對(duì)用于1D2→3H6，450 nm左右對(duì)用于1D2→3F4，475.5 nm左右對(duì)用于1G4→3H6，510.5 nm左右對(duì)用于1D2→3H5，646.5 nm左右對(duì)用于1G4→3F4，802.5 nm左右對(duì)用于3H4→3H6。

圖2  Yb3+離子和Tm3+離子的能級(jí)躍遷圖以及NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制

圖2為Yb3+離子和Tm3+離子的能級(jí)躍遷圖以及β-NaYF4:18%Yb,0.5%Tm的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制，圖中我們給出了樣品各個(gè)上轉(zhuǎn)換發(fā)射峰的電子布居過(guò)程。在980nm紅外激光激發(fā)下，Yb3+離子首先被激發(fā)，然后通過(guò)三步能量傳遞過(guò)程來(lái)布居Tm3+藍(lán)色上轉(zhuǎn)換發(fā)光能級(jí)1G4。第 一步：2F5/2→2F7/2(Yb3+):3H6→3H5(Tm3+)；第二步：Tm3+處于3H5能級(jí)上的電子快速無(wú)輻射弛豫到3F4能級(jí)，然后吸收一光子布居到3F2，3能級(jí)，2F5/2→2F7/2(Yb3+):3F4→3F2,3(Tm3+)；第三步：處于3F2,3能級(jí)上的電子快速無(wú)輻射弛豫到3H4能級(jí)，再吸收一光子能量布居到1G4能級(jí)，2F5/2→2F7/2(Yb3+):3H4→1G4(Tm3+)。布居1D2能級(jí)是通過(guò)能量傳遞3F2,3→3H6(Tm3+):3H4→1D2(Tm3+)完成的，為四光子過(guò)程。布居1I6能級(jí)是通過(guò)2F5/2→2F7/2(Yb3+):1D2→3P2(Tm3+)，3P2能級(jí)上的電子再無(wú)輻射弛豫到1I6能級(jí)，這一能量傳遞過(guò)程為五光子過(guò)程。

二、上轉(zhuǎn)換熒光壽命

     采用北京卓立漢光自主研發(fā)生產(chǎn)的OmniFluo“卓譜”熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)測(cè)試NaYF4:Yb/Tm的上轉(zhuǎn)換熒光壽命，激發(fā)光源選用980nm固體激光器，激光器調(diào)制頻率為50Hz，積分時(shí)間為1μs，測(cè)試發(fā)射波長(zhǎng)分別為345nm、450nm、475nm，分別如圖3、圖4、圖5所示。

圖3 發(fā)射波長(zhǎng)345nm

圖4 發(fā)射波長(zhǎng)451nm

圖5 發(fā)射波長(zhǎng)475nm

結(jié)論：
    多光子參與的上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程能夠?qū)⒌皖l率的激發(fā)光轉(zhuǎn)換成高頻率的發(fā)射光，在能源、YL、環(huán)保和通信等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用。北京卓立漢光自主研發(fā)生產(chǎn)的OmniFluo“卓譜”熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)，配備可調(diào)頻980nm固體激光器(可根據(jù)客戶需求，配置其它波長(zhǎng)激光器)。當(dāng)測(cè)試樣品的上轉(zhuǎn)換熒光光譜時(shí)，激光器工作于穩(wěn)態(tài)模式，便于調(diào)節(jié)光路；當(dāng)測(cè)試樣品的上轉(zhuǎn)換熒光壽命時(shí)，可直接對(duì)激光器進(jìn)行調(diào)頻，無(wú)需重新調(diào)節(jié)光路和樣品的擺放位置，即可得到測(cè)試結(jié)果。這樣既節(jié)省了換用激光器的調(diào)試時(shí)間，又保證了測(cè)量的準(zhǔn)確定，是您測(cè)試上轉(zhuǎn)換熒光以及熒光壽命的選擇。

OmniFluo“卓譜”熒光壽命測(cè)量系統(tǒng)

【本文作者：分析儀器事業(yè)部（AID）應(yīng)用研發(fā)部石廣立工程師】

（來(lái)源：北京卓立漢光儀器有限公司）

前言

許多發(fā)光材料的發(fā)光特性隨溫度、壓力或化學(xué)物質(zhì)的存在而變化。這種特性在發(fā)光傳感器的開發(fā)中得到了長(zhǎng)期的應(yīng)用。除了化學(xué)傳感外，發(fā)光測(cè)溫法也是最常用的傳感方法之一。與其他方法不同，它不需要宏觀的探針與探測(cè)區(qū)域進(jìn)行物理接觸。這是發(fā)光測(cè)溫法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。例如，可以功能化的發(fā)光納米顆粒進(jìn)入生物靶，熒光顯微鏡可以準(zhǔn)確探測(cè)不同區(qū)域的溫度。這種納米測(cè)溫法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的潛力，如：對(duì)溫度高于平均值的癌細(xì)胞進(jìn)行成像[1]。

發(fā)光測(cè)溫可以根據(jù)強(qiáng)度、線寬、光致發(fā)光壽命或光譜位移的變化來(lái)進(jìn)行。由于鑭系離子的穩(wěn)定性和窄光譜特性，很容易識(shí)別到這些變化，因此在溫度傳感的應(yīng)用中經(jīng)常使用鑭系離子[2]。此外，鑭系摻雜材料呈現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì): 可被近紅外(NIR)光激發(fā)，在光譜可見光區(qū)發(fā)射。近紅外光譜激發(fā)減少了生物組織的自吸收和散射，因此遠(yuǎn)程激勵(lì)變得更加容易。由于這一性質(zhì)，越來(lái)越多的溫度生物成像研究使用無(wú)機(jī)納米摻雜鑭離子制備上轉(zhuǎn)換納米顆粒 (UCNPs)[3]。

圖1. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)理的結(jié)構(gòu)示意圖，其中紅色和綠色的線代表發(fā)射躍遷。灰色的線代表非輻射躍遷。

圖1是上轉(zhuǎn)換熒光粉NaY0.77Yb0.20Er0.03F4發(fā)光機(jī)理的示意圖。至少需要兩個(gè)980nm的光子去激發(fā)樣品來(lái)產(chǎn)生可見區(qū)的發(fā)射。除了直接激發(fā)Er3+離子外，還存在從激發(fā)態(tài)Yb3+與Er3+激發(fā)態(tài)的能量轉(zhuǎn)移，該材料在可見光光譜的藍(lán)色、綠色和紅色區(qū)域發(fā)光。取決于躍遷過(guò)程中Er3+能級(jí)的高低。上轉(zhuǎn)換的測(cè)溫法通常集中使用525nm和540nm兩個(gè)波長(zhǎng)的發(fā)射峰，分別對(duì)應(yīng)2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2能級(jí)躍遷。2H11/2和2H11/2兩個(gè)能級(jí)在能量上緊密間隔，他們實(shí)際處于熱平衡狀態(tài)。因此，它們的粒子數(shù)比例可以用玻爾茲曼分布來(lái)表示:

式中，Ni是能級(jí)i上的粒子數(shù)，Δe是兩個(gè)能級(jí)間的能量差，k是玻爾茲曼常數(shù)，C是簡(jiǎn)并常數(shù)。

基于此，525nm與540nm處熒光強(qiáng)度的比值RHS可用來(lái)推出2H11/2與4S3/2的比值，從而能夠計(jì)算出樣品的溫度。愛丁堡(Edinburgh Instruments）熒光光譜儀FLS1000通過(guò)光纖耦合變溫臺(tái)能夠完成該測(cè)試項(xiàng)目。此變溫臺(tái)不僅能夠保證在FLS1000和顯微鏡下研究的為同一樣品，并且沒(méi)有任何中間樣品轉(zhuǎn)移步驟。本文通過(guò)FLS1000熒光光譜儀耦合變溫臺(tái)對(duì)上轉(zhuǎn)換樣品NaY0.77Yb0.20Er0.03F4進(jìn)行不同溫度下上轉(zhuǎn)換發(fā)光的測(cè)試。

測(cè)試方法與樣品

測(cè)試樣品為NaY0.77Yb0.20Er0.03F4上轉(zhuǎn)換發(fā)光粉末，購(gòu)置于Sigma Aldrich。將樣品放置于Linkam HFS350EV-PB4冷熱臺(tái)里的石英樣品池中。通過(guò)光纖將冷熱臺(tái)與FLS1000樣品倉(cāng)相連接。使用穩(wěn)態(tài)光源Xe2 980nm進(jìn)行激發(fā)，激光能量要低，以防止樣品變熱。使用980nm的激光器往往會(huì)造成樣品受激光照射而變熱[4]。FLS1000配置：雙單色器，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)器PMT-900。時(shí)間分辨的壽命測(cè)試使用脈沖氙燈(μF2)作為激發(fā)光源，采用MCS模式測(cè)試發(fā)光壽命。

測(cè)試結(jié)果與討論

使用FLS1000的Fluoracle中溫度mapping的測(cè)試功能，分別測(cè)試從-100℃到80℃每間隔20℃溫度范圍內(nèi)，樣品上轉(zhuǎn)換發(fā)射的紅光及綠光隨溫度的變化情況。結(jié)果如圖2（上轉(zhuǎn)化綠光）和3（上轉(zhuǎn)換紅光）所示。圖2 中上轉(zhuǎn)換綠光發(fā)射峰是由于Er3+的2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2兩個(gè)能級(jí)躍遷產(chǎn)生的。4S3/2 → 4I15/2和4F9/2 → 4I15/2對(duì)應(yīng)發(fā)射峰的強(qiáng)度隨著溫度升高而降低。但是2H11/2 → 4I15/2對(duì)應(yīng)的譜待變化的稍有不同：在273K以下，隨著溫度的增加其發(fā)光強(qiáng)度降低。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，增長(zhǎng)緩慢。

圖2. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4溫度相關(guān)的發(fā)射圖譜（綠光部分）。使用耦合Linkam冷熱臺(tái)的FLS1000光譜儀進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件：λex=980 nm, Δλex=10 nm, Δλem=10 nm, 步進(jìn)step=0.10nm, 積分時(shí)間=1s/step。內(nèi)插圖為對(duì)應(yīng)2H11/2→ 4I15/2躍遷的發(fā)射范圍的放大圖。

圖3. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4溫度相關(guān)的發(fā)射圖譜（紅光部分）。使用耦合Linkam冷熱臺(tái)的FLS1000光譜儀進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件：λex=980nm, Δλex=10nm, Δλem=10nm, 步進(jìn)step=0.10nm, 積分時(shí)間=1s/step。

圖4. NaY0.77Yb0.20Er0.03F4溫度相關(guān)的壽命三維譜圖。使用耦合Linkam冷熱臺(tái)的FLS1000光譜儀進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試2H11/2→ 4I15/2對(duì)應(yīng)的發(fā)射。測(cè)試條件：λex=980nm, Δλex=15nm, λem=541nm ，Δλem=10nm, 燈源頻率=100Hz, 采集時(shí)間：每條衰退曲線采集5分鐘。紅色和藍(lán)色曲線分別代表-100℃和40℃下的測(cè)試結(jié)果。隨著溫度的增加，非輻射弛豫過(guò)程降低了整體的上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程。有關(guān)溫度的猝滅的動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)圖4所示的溫度相關(guān)的三維壽命譜圖來(lái)進(jìn)行研究，當(dāng)溫度增加時(shí)，該樣品的發(fā)光壽命從640μs降低至530μs，有明顯下降?；氐綀D2和圖3，從4S3/2 ，2H11/2 到4F9/2的弛豫過(guò)程相對(duì)增加了紅色光的發(fā)射強(qiáng)度。這可以從圖5（a）的溫度Rrg函數(shù)看出。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值，RHS是優(yōu)異的溫度指數(shù)參數(shù)(前言已介紹過(guò))，圖5（b）是RHS隨溫度的變化圖，圖5（c）是相同數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值。有趣的是，RHS并沒(méi)有遵循玻爾茲曼曲線：在高溫下，額外的弛豫過(guò)程發(fā)生并引發(fā)4S3/2 → 4I15/2躍遷的“緩慢增加”。這與之前的報(bào)告一致[5,6]，證明了上轉(zhuǎn)換的復(fù)雜動(dòng)力學(xué)過(guò)程: 4H11/2到 4S3/2的非輻射過(guò)程在高溫下變得更為重要，所以粒子數(shù)與RHS不相等。應(yīng)該指出不同溫度下的RHS 很大程度上取決于樣品顆粒的大小[4,6]。為了說(shuō)明上轉(zhuǎn)換測(cè)溫的概念，將曲線的低溫區(qū)域擬合到圖5 (c)所示的直線玻爾茲曼圖中，可以得到熒光測(cè)溫系統(tǒng)S的相對(duì)靈敏度。這是評(píng)價(jià)發(fā)光溫度計(jì)系統(tǒng)的一個(gè)有用參數(shù)，計(jì)算方法如下:

圖5的斜率為-ΔE/k, 在20℃的靈敏度為1.0%K-1。這一結(jié)果與類似的上轉(zhuǎn)換測(cè)溫系統(tǒng)是一致的。

圖5.  上轉(zhuǎn)換發(fā)射帶強(qiáng)度的比值隨溫度變化的函數(shù)圖：（a）紅光和綠光的比值（b）2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值 (c) 圖(b)的對(duì)數(shù)數(shù)據(jù)圖。與玻爾茲曼圖第 一部分的線性擬合如(c)所示。

結(jié)論

NaY0.77Yb0.20Er0.03F4溫度相關(guān)上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度及壽命均可使用愛丁堡熒光光譜儀FLS1000 耦合Linkam冷熱臺(tái)進(jìn)行測(cè)試。2H11/2 →4I15/2和4S3/2 → 4I15/2的比值可作為發(fā)光測(cè)溫系統(tǒng)中的溫度探針，其靈敏度為1.0%K-1。通過(guò)光纖耦合的Linkam冷熱臺(tái)附件能夠使用戶在發(fā)光測(cè)試和顯微鏡下靈活輕松切換，中途不需要樣品轉(zhuǎn)移步驟。

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