在疫情仍未停歇的當(dāng)下，做好個(gè)人防護(hù)對(duì)每個(gè)人來說既是簡單的，又是必要的。而群體防護(hù)的順利實(shí)施，則要?dú)w功于抵抗新冠的各類疫苗了。這其中，就有免疫效果不錯(cuò)的mRNA疫苗。mRNA疫苗具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和顯著的治療優(yōu)勢，因而成為諸多藥企競相追逐的熱點(diǎn)。本期，小編就帶大家了解一下mRNA疫苗開發(fā)的工藝流程。

01 DNA原液供應(yīng)

質(zhì)粒 DNA (pDNA) 是mRNA疫苗生產(chǎn)不可或缺的原材料，可用作 mRNA 的模板。在制備時(shí)，第一步是要提取病毒刺突蛋白的DNA序列，然后構(gòu)建帶有該序列的DNA質(zhì)粒，接著經(jīng)過擴(kuò)增、純化、質(zhì)檢等諸多過程形成我們最終所需的DNA原液。

在mRNA疫苗開發(fā)應(yīng)用方面，質(zhì)粒生產(chǎn)也面臨著諸多的壓力，尤其是 GMP的壓力。

02 mRNA原液制備 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）是mRNA原液制備的主要手段。pDNA 可作為IVT的模板，合成所需的 mRNA 分子。 IVT的工藝比較復(fù)雜，除使用pDNA外，還需要添加合成mRNA的必要成分，如核苷酸和mRNA聚合酶。為提高mRNA穩(wěn)定性，降低其免疫原性，還需在 mRNA的5'末端添加加帽試劑。除此之外，合理設(shè)計(jì)5'或3'非翻譯區(qū)(UTR)也可以調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的翻譯效率。 mRNA的純度影響著翻譯后蛋白的效力，因此，mRNA原液制備后的純化過程也是必不可少的，可采用TFF（切向流過濾）或SEC（尺寸排阻色譜）等方法來去除少量殘留雜質(zhì)。

03 mRNA包封 為防止疫苗有效成分mRNA進(jìn)入細(xì)胞前被降解，可采用脂質(zhì)納米顆粒(LNP)對(duì)其進(jìn)行包裹。具體過程為：將各種脂質(zhì)成分按一定的比例進(jìn)行混合，溶解在乙醇或其他有機(jī)溶劑中；將mRNA溶解于水中，并用酸性緩沖液稀釋至合適濃度。配置好的兩相溶液在微流控設(shè)備上進(jìn)行均勻混合，快速制備包裹mRNA的核酸脂質(zhì)納米顆粒。與微流控設(shè)備匹配的核心耗材為微流控芯片，圖1即為芯片內(nèi)部通道示意圖。 

圖1.微流控芯片通道示意圖

04 后處理 mRNA包封后需要進(jìn)一步的純化。可通過超濾去除有機(jī)相以及未包封的游離成分。超濾過程中可以進(jìn)行溶劑緩沖體系的置換，以及PH值的調(diào)節(jié)，最終復(fù)合物的濃度根據(jù)需求進(jìn)行靈活控制。 

圖2.超濾管

 至于細(xì)菌、微生物的清除，一般采用0.22μm的除菌級(jí)過濾器即可。 純化后的mRNA-LNP溶液還可以添加必要的輔料成分，以提升產(chǎn)品長期保存的穩(wěn)定性。

05 儲(chǔ)存運(yùn)輸 mRNA疫苗布局開發(fā)過快也帶來了些不可避免的問題，即需要低溫來保持疫苗穩(wěn)定，這大大的提升了對(duì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)囊?。在?chǔ)存運(yùn)輸過程中需進(jìn)行持續(xù)的溫度監(jiān)測，以確保產(chǎn)品始終處于規(guī)定的溫度范圍，否則很難保證最終患者給藥時(shí)產(chǎn)品的安全性和有效性。 總結(jié)：mRNA疫苗有著廣闊的應(yīng)用前景，其開發(fā)過程也必然充滿挑戰(zhàn)。了解開發(fā)的各個(gè)工藝流程，方能鎖定難點(diǎn)，各個(gè)擊破，向疫苗的成功開發(fā)更進(jìn)一步。  

納米藥物制備系統(tǒng)

應(yīng)用范圍：

● 核酸藥物發(fā)展的前沿方向

● mRNA疫苗的開發(fā)與挑戰(zhàn)

● 核酸脂質(zhì)納米?？破铡獪\談儀器參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響

● 核酸脂質(zhì)納米粒科普——超濾管規(guī)格

● 核酸脂質(zhì)納米?？破铡筇幚?/p>

 
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早在幾十年前，研究者們首次發(fā)現(xiàn)，外源的mRNA經(jīng)肌肉注射至小鼠體內(nèi)后有相應(yīng)的蛋白表達(dá)，這也成為了mRNA疫苗的雛形。人們一直以來都希望能夠生產(chǎn)出一種靈活、易于生產(chǎn)、安全有效的疫苗。而mRNA疫苗就是一種可以滿足這些需求的，具有良好的發(fā)展前景的新疫苗。而時(shí)至今日，在新冠疫情的背景下，mRNA疫苗也不負(fù)重望的成為了一顆耀眼的明星，輝瑞、Moderna等公司的mRNA新冠疫苗相繼展現(xiàn)出了良好的預(yù)防效果，使得mRNA疫苗愈發(fā)受到人們的關(guān)注。
而合適的mRNA遞送載體一直是制約mRNA疫苗發(fā)展的一大瓶頸，一個(gè)合適的mRNA遞送載體可實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的GX包載，并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的表達(dá)效果。目前常用的幾種mRNA遞送載體主要包括：聚合物材料、多肽、脂質(zhì)納米粒。下面我們就簡要介紹一下這幾種mRNA遞送載體。


（一） 聚合物材料

早期人們采用聚合物材料來進(jìn)行核酸的遞送，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、聚氨基酯（PBAE）、殼聚糖等。大多數(shù)用于mRNA遞送的聚合物材料都需要進(jìn)行脂肪酸鏈的修飾，以改善其安全性，但這些材料的應(yīng)用目前都只停留在臨床前研發(fā)階段。有研究就采用PEI用于將DNA通過吸入的方式輸送到肺部。然而PEI不易分解，因此對(duì)于可能需要的重復(fù)給藥，聚合物可能累積并引起副作用。【1】也有研究采用分支型的聚胺基聚合物進(jìn)行mRNA的包載，構(gòu)建一套樹狀聚合物RNA納米粒，并成功在體內(nèi)表達(dá)出了對(duì)抗翟卡病毒、埃博拉病毒的相關(guān)抗體?！?】

圖1. 麻省理工研究團(tuán)隊(duì)采用

聚合物材料制備的mRNA納米粒【1】

（二） 多肽

也有少量的研究中采用了細(xì)胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）用于mRNA的遞送，如采用包含有兩親性序列精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（Arg-Ala-Leu-Ala）的細(xì)胞穿膜肽來結(jié)合mRNA構(gòu)建成一種CPP-mRNA復(fù)合納米粒，其可以發(fā)揮CPP跨越細(xì)胞膜的能力，將mRNA很好的遞送到細(xì)胞內(nèi)，并引發(fā)了良好的T細(xì)胞應(yīng)答?！?】

（三）脂質(zhì)納米粒

人們采用離子化的脂質(zhì)進(jìn)行siRNA的遞送，并在2018年由Alnylam制藥公司推出了上市的RNAi藥物Onpattro，其就是通過離子化的脂質(zhì)制備的脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）進(jìn)行siRNA的包載和遞送。受其啟發(fā)，目前研究者們也紛紛選擇LNPs作為mRNA遞送的載體。LNPs主要通過陽離子的磷脂材料與其他輔助磷脂完成顆粒的構(gòu)建，通過RNA所帶的負(fù)電與陽離子磷脂的正電相互吸附，可實(shí)現(xiàn)較高的包載效果，并且在體內(nèi)由低密度脂蛋白介導(dǎo)的胞吞機(jī)制可使納米粒子成功被細(xì)胞攝取，實(shí)現(xiàn)良好的細(xì)胞攝取效果。在胞內(nèi)經(jīng)由內(nèi)含體途徑將mRNA成功釋放，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白表達(dá)。同時(shí)良好的體內(nèi)安全性也使他更具競爭力，在多種傳染性疾病的預(yù)防及ZL方面展現(xiàn)出了較好的效果。其中已有大量的研究已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究階段，如在兩項(xiàng)臨床一期的流感病毒疫苗研究中，通過LNPs包載核苷酸修飾的mRNA，所產(chǎn)生的機(jī)體免疫應(yīng)答與傳統(tǒng)的滅活流感病毒疫苗相似，并且安全性也基本一致?！?】在新冠疫情的背景下，輝瑞與Biotech的mRNA疫苗更是緊急上市，同樣采用LNPs作為mRNA的遞送載體，并展現(xiàn)出了超過90%的有效率。

圖3. 常見的LNPs構(gòu)造

目前在多種mRNA遞送載體中，LNPs還是更優(yōu)的選擇，但是如何開發(fā)出新的配方材料，打破相關(guān)ZL壁壘，同樣是相關(guān)研究者爭相努力的方向。同時(shí)伴隨著RNA序列編輯、RNA的大批量快速生產(chǎn)等相關(guān)研究的進(jìn)一步發(fā)展，未來mRNA疫苗相關(guān)技術(shù)會(huì)愈發(fā)成熟，會(huì)引領(lǐng)接下來一段時(shí)間的藥物研發(fā)相關(guān)的風(fēng)潮。
 

參考文獻(xiàn)：

1. James Cliff Kaczmarek, Kevin J Kauffman et al.: Optimization of a Degradable Polymer-Lipid Nanoparticle for Potent Systemic Delivery of mRNA to the Lung Endothelium and Immune Cells. Nano Lett 2018, DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b02917.

2. Chahal JS, Khan OF, Cooper CL et al.:Dendrimer-RNA nanoparticles generate protective immunity against lethal Ebola, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii challenges with a single dose. Proc Natl Acad Sci USA 2016,113:E4133-4142.

3. Udhayakumar VK, De Beuckelaer A et al.: Arginine-rich peptide-based mRNA nanocomplexes efficiently instigate cytotoxic T cell immunity dependent on the amphipathic organization of the peptide. Adv Healthc Mater 2017, 6.

4. Feldman RA, Fuhr R et al.: mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials. Vaccine 2019, 37:3326-3334.

納米藥物制備系統(tǒng)

應(yīng)用范圍：

顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀應(yīng)用于mRNA疫苗注射劑

隨著2019年疫情在大范圍內(nèi)的大流行，新冠疫苗也再一次被人們重視起來，今天梓夢科技的小編就想和大家聊聊關(guān)于mRNA疫苗檢測時(shí)需要用到顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀檢測的問題。

在說具體的顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀檢測的流程之前，梓夢科技的小編先介紹一下什么是mRNA疫苗。眾所周知，mRNA疫苗是繼滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗后的第三代疫苗,具有針對(duì)病原體變異反應(yīng)速度快、生產(chǎn)工藝簡單、易規(guī)?；瘮U(kuò)大等特點(diǎn)，它的基本原理是通過特定的遞送系統(tǒng)將表達(dá)抗原靶標(biāo)的mRNA導(dǎo)入體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)出蛋白并刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，從而使機(jī)體獲得免疫保護(hù)。我們都知道當(dāng)mRNA疫苗研發(fā)成功之后不能被立即使用，在使用之前是需要進(jìn)行檢測的，這時(shí)候?qū)τ趍RNA疫苗的檢測方法就需要顯微計(jì)數(shù)法以及需要使用顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀來檢測。下面就讓小編給您介紹一下進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀檢測時(shí)需要用到的配件展示。

顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀配件展示：

（1）樣品過濾裝置，烘干裝置，檢測分析軟件，電腦等。

（2）需要配置奧林巴斯反射顯微鏡、徠卡金相顯微鏡、尼康金相顯微鏡或者國產(chǎn)反射系統(tǒng)顯微鏡均可。

顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀儀器展示：

mRNA疫苗樣品展示：

以下是具體的顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀檢測步驟：

（1）首先對(duì)空白濾膜進(jìn)行檢查，將空白濾膜放置于測試平臺(tái)，對(duì)整個(gè)濾膜進(jìn)行掃描后做分析，確保濾膜本身是干凈的。

（2）把濾膜潤濕之后放置在過濾裝置上，固定后倒入樣品，進(jìn)行抽濾，然后用50ml檢查用水沖洗。

（3）將濾膜取出，放入到金屬浴中進(jìn)行烘干，烘干溫度45℃，一般大約10分鐘左右即可。

（4）用專用平頭鑷子將烘干的濾膜放入顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀下，進(jìn)行整圖掃描。

（5）分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告；

通過以上梓夢科技的小編介紹的顯微計(jì)數(shù)法的檢測步驟，很多感興趣的朋友肯定會(huì)疑惑，擁有顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀和會(huì)使用顯微計(jì)數(shù)法檢測的的公司那么多，為什么還要梓夢科技的顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀來檢測呢？原因是梓夢科技的顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀MIP-01Z具有以下的優(yōu)勢：

①　直接按照藥典要求出具報(bào)告；

②　全自動(dòng)進(jìn)行濾膜全掃描，并進(jìn)行顆粒圖片分析；

③　軟件符合法規(guī)要求；

④　按照顆粒性質(zhì)進(jìn)行歸類分析統(tǒng)計(jì)；

⑤　光阻法檢測不通過時(shí)，作為不溶性微粒檢測的一個(gè)判定。

通過梓夢科技小編的介紹，相信對(duì)顯微計(jì)數(shù)法如何檢測mRNA疫苗的流程的朋友都已經(jīng)清楚了，如果對(duì)梓夢科技的顯微計(jì)數(shù)法不溶性微粒儀感興趣的朋友歡迎咨詢上海梓夢科技。