參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  容貌廈墾 2016-06-23 00:00:00

  　　很簡單的啊。 　　流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析 　　5.1 數(shù)據(jù)采集及顯示 　　光信號轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計算機(jī)能夠儲存處理的數(shù)字信號。 流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標(biāo)準(zhǔn)格式存儲，該標(biāo)準(zhǔn)由“分析細(xì)胞學(xué)協(xié)會”制定。 　　根據(jù)FSC標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)存儲格式應(yīng)包括三個文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。 4參數(shù)（FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE）的單細(xì)胞分析會生成8位數(shù)據(jù)。當(dāng)單個樣品累計收集到10000個細(xì)胞時，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB. 　　數(shù)據(jù)采集存儲完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量（如圖5-1）。處在同一通道的每一細(xì)胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側(cè)信號的熒光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強(qiáng)。 圖5-1 流式數(shù)據(jù)分析圖 　　雙參數(shù)可在二維散點(diǎn)圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。3維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細(xì)胞量（如圖5-1）。 　　習(xí)題：數(shù)據(jù)采集及顯示 　　1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 . 　　2 二維點(diǎn)圖用于顯示 參數(shù)。 　　3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表 . 　　5.2 設(shè)門 　　通過設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。 圖5-2 全血樣本中淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖 　　習(xí)題：設(shè)門 　　1 設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細(xì)胞。（對 錯） 　　5.3 細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析 　　數(shù)據(jù)分析包括從點(diǎn)圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù)，然后統(tǒng)計點(diǎn)圖中的細(xì)胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點(diǎn)圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過設(shè)門的方法區(qū)分指定的細(xì)胞亞群。 如圖5-3所示，在淋巴細(xì)胞亞群周圍設(shè)門，以單獨(dú)分析或分選該亞群細(xì)胞。 　　圖5-3 選定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門 　　門內(nèi)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細(xì)胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點(diǎn)圖和三維圖來分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點(diǎn)圖可設(shè)置象限標(biāo)志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計表以輸出結(jié)果。 直方圖可直觀單個參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（見圖5-4）。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。 　　圖5-4 陰性對照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰M2（NORM002） 圖5-5的統(tǒng)計結(jié)果表明，整個事件共記錄了6000個細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個。其中M1（陰性）細(xì)胞619個，M2（CD3陽性）細(xì)胞2272個細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%. 　　圖5-5 直方圖統(tǒng)計結(jié)果 　　二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個點(diǎn)表示一個或多個細(xì)胞。圖5-6為陰性對照圖，用于設(shè)定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽性細(xì)胞以及雙陽性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽性細(xì)胞（CD19 PE），左下象限（LR）為X軸陽性細(xì)胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。 　　圖5-6 陰性對照組（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本（NORM002） 如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%. 　　圖5-7 散點(diǎn)圖統(tǒng)計結(jié)果 另一個分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖5-8所示）；然后統(tǒng)計該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細(xì)胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%. 　　圖5-8 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本分析圖 圖5-9 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果 　　這種方法在分析不同的供體細(xì)胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細(xì)胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細(xì)胞亞群位置會發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。 為避免這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點(diǎn)是會隨著整個細(xì)胞亞群的移動而移動，自動變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細(xì)胞亞群位置（見圖5-10）。 　　圖5-10 使用Attractors分析軟件時二維點(diǎn)圖的前后變化對比 　　5.4 流式細(xì)胞儀的其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析 　　這些分析方法通常適用于計算離散細(xì)胞群的百分含量，對于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細(xì)胞株是單個細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是陰性，也不是陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計細(xì)胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽性率越高。 如圖5-11所示，左圖為單細(xì)胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。 　　圖5-11 單細(xì)胞株分析圖 除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。 　　QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取的信息，用于計算每個細(xì)胞的接合點(diǎn)位數(shù)。 圖5-12 使用QuantiCALC軟件計算每個細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 我們使用ModFit LTTM軟件進(jìn)行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果。 　　圖5-13 細(xì)胞周期的DNA直方圖 　　習(xí)題：數(shù)據(jù)分析 　　1二維點(diǎn)圖和一維直方圖的作用分別是什么？ 　　2 見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。 　　3 LL象限代表雙陽性細(xì)胞亞群。（對 錯） 　　4 見圖5-6和圖5-7，淋巴細(xì)胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。 　　5 只能使用矩形設(shè)定細(xì)胞區(qū)域范圍。（對 錯） 　　6 使用區(qū)域設(shè)定法分析樣本有哪些不足。 　　7 避免細(xì)胞亞群移動的分析方法是什么。 　　8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。 　　5.5 CellQuest和CellQuest Pro軟件使用 　　CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運(yùn)用Z為廣泛的流式細(xì)胞儀采集及分析軟件。它運(yùn)行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)Z新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時的強(qiáng)大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuest Pro軟件主安裝在BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀上。 　　1.軟件數(shù)據(jù)流程 　　在CellQuest和CellQuest Pro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個部分：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點(diǎn)圖、設(shè)門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關(guān)系?？梢允褂梅桨高M(jìn)行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個采集方案分析樣本后會生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0. 　　數(shù)據(jù)包必須由方案文件打開，無法單獨(dú)顯示，或者可由第三方軟件進(jìn)行分析，如WinMDI. 　　2.軟件與儀器的連接 　　流式細(xì)胞儀需要加電開啟后會向計算機(jī)發(fā)出信息，所以如要進(jìn)行實驗需要先開啟流式細(xì)胞儀，然后再開啟計算機(jī)。 　　1、\x09先開儀器后開計算機(jī)，以確保儀器和計算機(jī)之間的正常通訊。 　　2、\x09在蘋果菜單下點(diǎn)擊CellQuest和CellQuest Pro軟件。 　　3、\x09從Aquire菜單下選擇connet to cytometer. 　　3.方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系 　　CellQuest和CellQuest Pro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨(dú)立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進(jìn)行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點(diǎn)圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis. 　　當(dāng)圖的屬性為Acquire時，此圖只限于采集下用，即只當(dāng)進(jìn)行檢測時它才能顯示顆粒； 　　當(dāng)圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。 　　當(dāng)圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。 　　所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點(diǎn)圖全部設(shè)為Acquire-Analysis屬性。 　　CellQuest Pro CellQuest 　　4.方案的建立 　　A選擇實驗參數(shù) 　　默認(rèn)情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀開機(jī)后只打開一根激光器，及五個參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3.當(dāng)我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動打開633nm激光器。 　　B，建立散點(diǎn)圖或直方圖，命名坐標(biāo) 　　CellQuest Pro軟件主要工作界面，軟件類似于Office word的工作面，可在A4大小的頁面上進(jìn)行編輯建立各種直方圖或散點(diǎn)圖。 　　在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來打開圖的屬性對話框，其中包括了關(guān)于該圖所有選項。 　　建立好直方圖或散點(diǎn)圖后，我們需要對所選的參數(shù)進(jìn)行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4. 　　在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description，可出現(xiàn)關(guān)于文件存儲和參數(shù)命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數(shù)，并在此對每個采集參數(shù)進(jìn)行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE…… 　　C，設(shè)門并建立門與圖之間的關(guān)系 　　R與G的關(guān)系 　　R是Region的shou個字母，Region一般是指一個閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進(jìn)行邏輯運(yùn)算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。當(dāng)區(qū)域進(jìn)行運(yùn)算時軟件引進(jìn)了算術(shù)公式的管理概念： 　　Gate實際了個代數(shù)式，簡稱G，其運(yùn)算式默認(rèn)如下： 　　G1 = R1，或G2=R2 　　當(dāng)我們要進(jìn)行邏輯運(yùn)算時，可變更為G1=R1 AND R2.此時G1就成了一個算術(shù)結(jié)果了。 　　G1=R1 AND R2 　　G2=R1 NOT R2 　　G3=R1 OR R2 　　Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對門進(jìn)行邏輯運(yùn)算和標(biāo)識顏色的工具。 　　建立門與圖之間的關(guān)系 　　打開要編輯的直方圖或散點(diǎn)圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。 　　D，顯示統(tǒng)計參數(shù) 　　5.儀器的操作 　　當(dāng)計算機(jī)與流式細(xì)胞儀聯(lián)機(jī)后便會出現(xiàn)以下采集控制框： 　　在有關(guān)儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框： 　　6.文件的保存及調(diào)用 　　實驗或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件： 　　如要打開這些分析方案只需雙建方案圖標(biāo)即可；方案可以分析以往的數(shù)據(jù)包（前提是方案中的直方圖或散點(diǎn)圖都已定義成Acquire-Analysis屬性），有兩種方案打開以往的數(shù)據(jù)： 　　方法一：選擇直方圖或散點(diǎn)圖，打開該圖的屬性框（Plot-》Format），見下圖： 　　在以上紅色框標(biāo)注的地方選擇要分析的數(shù)據(jù)包。 　　方法二：選中方案中所有的直方圖或散點(diǎn)圖，打開Plots菜單，選擇Chang Data File，打開要分析的數(shù)據(jù)包。

  贊(2)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論