HILIC分離機制

HILIC是一種復雜的分離技術(shù)，通過多種相互作用模式來實現(xiàn)保留。

這些相互作用的權(quán)重（中哪種是主要作用）是基于固定相、流動相和分析物的理化特性。

為了得到可靠和穩(wěn)健的HILIC方法，了解潛在的不同相互作用（了解可能存在的不同相互作用）是很有幫助的。

這樣可以為待進行的方法開發(fā)合理選擇色譜柱和條件。（這樣可以為方法開發(fā)的色譜柱和條件做出合理的選擇）
HILIC中的流動相通常包含大量的乙腈（>70%）以及至少3%的水。

水性組分使得極性固定相周圍存在親水環(huán)境，并且形成吸附水層以便分析物分散（分配）。

主要的HILIC保留機制包括：
分析物分散（分配）到吸附水層，各種極性相互作用和靜電（即離子交換式）相互作用（參見圖3）。

如果將極性分析物通入（極性分析物進入）HILIC環(huán)境中，則可使用這些保留機制中的任意一種（則物質(zhì)的保留可能是任何一種機制作用，也可能是所有機制同時作用）。

圖3
潛在HILIC保留機制圖示

極性分析物通常包含能夠與其它極性基團相互作用的各種基團，如：固定相上的基團。極性相互作用包括氫鍵和偶極-偶極與其它基團的相互作用。帶

電分析物也可以進行靜電或離子交換式相互作用，其中分析物可以被固定相吸引或排斥。

例如，一個帶負電的或酸性的分析物會被帶負電的（即酸性的）固定相排斥。

但是，帶正電的或堿性的分析物可被帶負電的（酸性的）固定相保留，反之亦然。

ACE HILIC色譜柱固定相：

過去，許多HILIC固定相都采用非鍵合硅膠。

這些酸性相提供了必要的相（固定相必要的）極性，以在（使其能）HILIC模式中與高有機物含量洗脫劑很好地相互作用。

非鍵合硅膠相很有（好）用，所以仍在廣泛使用。

Z近，在市場上已經(jīng)可以買到專門用于HILIC環(huán)境的各種鍵合相（固定相）。

這些新的極性鍵合相根據(jù)相（固定相的）特性可分為很多種，包括酸性的、堿性的、中性的和新型的化學相。

ACE HILIC組合目前包括酸性的、中性的和堿性的固定相。

這些相已被證實可相互提供不同的選擇性。
這些（三款）ACE相（固定相）彼此提供了替代選擇性，可參見圖4.九種組分混合物中的中性和帶電分析物，在相同條件下，對三種不同的ACE HILIC相（在三款不同固定相的ACE HILIC色譜柱上）顯現(xiàn)出不同的保留和洗脫順序。

這清楚地表明：HILIC模式下各ACE HILIC固定相之間存在選擇性差異，使得這三種色譜柱成為HILIC方法開發(fā)的理想選擇。

圖4
ACE HILIC固定相范圍內(nèi)洗脫順序的對比
色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 254 nm
樣品：
1) 對氨基苯甲酸
2) 4-羥基苯甲酸
3) 煙酰胺
4) 醋丁洛爾
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛爾
9) 2’-脫氧鳥苷

ACE HILIC-A相

ACE HILIC-A相能形成負電荷，并顯示出高（強）陽離子交換能力。

帶電的堿基（堿性物質(zhì)）對ACE HILIC-A相進行（產(chǎn)生）靜電吸引，而帶電的酸性物質(zhì)則被排斥。
ACE HILIC-A相的帶電程度取決于流動相的pH值。

ACE HILIC范圍的推薦pH限值為pH2.0到pH7.0。

通過增大pH值，固定相上的負電荷將變得更明顯，從而保留更多的陽離子分析物。

ACE HILIC-N相

中性ACE HILIC-N相對陰陽離子都顯示出較低的離子交換能力。

ACE HILIC-N相的保留機制包括極性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）。

ACE HILIC-B相

ACE HILIC-B相具有合理的陰離子交換能力，從而可保留酸性分析物，同時堿性分析物將被排斥。

與ACE HILIC-A相似，pH值可影響固定相的電荷，因此可減弱或增強該相的正特性（該相的正電荷特性）。

利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實現(xiàn)分離目標的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過更快速的分離和更快速的方法開發(fā)提高實驗室生產(chǎn)力來證明了其價值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見圖1）通過利用柱效和選擇性，通?？梢詫崿F(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發(fā)分離方法時的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機制，這可以用來實現(xiàn)分離。

這些相互作用機制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機制，這取決于分析物和流動相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機制/相互作用                                                                                    

利用鍵合相的選擇性實現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機制（特別是疏水性結(jié)合）的強度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機制，可以為復雜的混合物帶來更好的分離效果。對于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢。

當開發(fā)分離方法時，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機制。

非常強大且獨特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過利用柱效和選擇性，可以實現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實例。

一個分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測：UV 254 nm

樣品
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。

具有獨特選擇性的C18 鍵合相：
1.有保證的可重現(xiàn)性
2.的鍵合相穩(wěn)定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色譜分離度
色譜分離的目標是在Z短的時間內(nèi)獲得目標組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實現(xiàn)基線分離，然而對于可以在實驗室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

增加分離度Rs可以通過增加N、α或k來實現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過增加柱長或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來增加N。

無論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過增加N實現(xiàn)令人滿意的分離，其“成本”可能是極高的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會增加Rs，但回報率也快速下降。

將k增加至超過10通常是Rs與分析時間之間的不利權(quán)衡，因為只有Rs的邊際收益隨著保留時間的增加而實現(xiàn)。

該效應的圖形表示參見下述圖1。

圖1 N、α和k對分離度(Rs)的影響
對于典型的分離，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分離度(Rs)。

然而，從這些圖中可以看出，N或k的提高都會迅速降低回報率。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發(fā)分離方法時的Z佳優(yōu)化變量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會受回報率下降的約束。

α的變化對壓力沒有影響，對分離時間的影響也是微乎其微的（參見圖2）。

因此，在開發(fā)分離方法時，α是Z重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標峰之間達到滿意的分離度，同時保持系統(tǒng)背壓和分離時間在可接受范圍內(nèi)。

改善色譜分離度- 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動相、溫度和固定相化學物質(zhì)控制。大多數(shù)方法開發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標準”3μm C18相沒有達到足夠的分離度，推薦優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實例所示。
通過簡單地將固定相化學物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲V選擇性的固定相化學物質(zhì)，易于在標準HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復雜的流動相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

圖2利用選擇性實現(xiàn)快速、高分離度的分離

樣品：1）對乙酰氨基酚2）氫氯噻嗪3）甲基苯基亞砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 溫度：40°C 檢測：UV, 254 nm 流動相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分鐘內(nèi)3- B
比較數(shù)據(jù)不代表所有應用。

在保持C18鍵合相的同時，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會導致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個關(guān)鍵對提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。

PFP分離機制
ACE C18-PFP相顯示有多個保留機制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性。

雖然下述部分提供了相對強度的近似值，但每個保留機制的優(yōu)勢由溶質(zhì)的物理/化學性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)和所采用的色譜條件決定。

π-π相互作用

PFP環(huán)在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因為電負性氟原子會產(chǎn)生缺電子的苯環(huán)，使得PFP相可以作為路易斯酸而起作用。

這將與能夠給出電子的分析物（即路易斯堿）相互作用。
這與苯基相相反，苯基相含有富電子芳香環(huán)（由于不存在吸電子基團），因此它們可以作為路易斯堿而起作用。

偶極-偶極和氫鍵

PFP環(huán)中的碳-氟鍵具有強極性。

因此，PFP相可以通過在分析物與電負性氟原子之間發(fā)生的偶極-偶極或氫鍵相互作用來額外保留分析物。

任何這樣的相互作用將導致保留增加。

形狀選擇性

PFP具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，當與其它可能的保持機制相結(jié)合時，可以賦予PFP相優(yōu)異的形狀選擇性。

ACE C18-PFP相顯示有PFP相的多重保留機制，色譜科學家們可能會利用這些機制來解決在傳統(tǒng)C18相（僅主要依賴于疏水保留機制）上難以分離（即使并非不可能）的混合物。