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  lance阿斯蘭 2016-08-29 00:00:00

  反相液相色譜柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚，是液相色譜分離模式中使用Z為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質(zhì)及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關(guān)．反相色語法是以表面非極性載體為固定相，面以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動相的—種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多采用離子強(qiáng)度較低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、異內(nèi)醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大于300Å的硅膠鍵合烷基固定相應(yīng)用較為普遍，聚合物基質(zhì)的反相色譜固定相也有較多應(yīng)用． 反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強(qiáng)而增大，對于非極性化合物通常遵循以下規(guī)則：(弱)非鍵合硅膠 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(強(qiáng))．溶質(zhì)保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80Å)的表面積約為250m2/g，而300Å孔徑載體的比表面積約為60m2/g。當(dāng)其他條件相同時，溶質(zhì)在300Å孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80Å孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于強(qiáng)親水性樣品洗脫．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強(qiáng)度來調(diào)整，溶劑強(qiáng)度取決于有機(jī)溶劑的性質(zhì)和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，采用高溶劑強(qiáng)度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化，氰基、苯基、C8、C18等柱的選擇性有很大差異，一般應(yīng)優(yōu)先考慮C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱． 反相條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于低PH、有機(jī)溶劑存在、溫度高于室溫和疏水鍵合相等綜合原因發(fā)生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨(dú)立或動態(tài)平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導(dǎo)致譜峰展寬、變形、甚至出現(xiàn)單一蛋白有多個峰的現(xiàn)象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脫蛋白的回收率低和鬼峰．反相色譜固定相表面烷基鏈長度對蛋白質(zhì)的反相保留和蛋白質(zhì)的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(C8、C22、C30)，固定相疏水性越強(qiáng)，為使蛋白質(zhì)等生物分子洗脫，流動相合機(jī)溶劑的含量較高，疏水性過強(qiáng)，會導(dǎo)致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分離中表現(xiàn)出優(yōu)勢。對多數(shù)小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開并避免聚集或沉淀，能夠得到理想的分離結(jié)果． 在低pH流動相條件下進(jìn)行分離，如(0.1% TFA適合于大多數(shù)樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)更有利；以乙腈作有機(jī)溶劑，丙醇可能對疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)有利；柱溫50~80℃；將樣品溶于6mol/L尿素或鹽酸胍中(只可在室溫)進(jìn)行預(yù)處理；用疏水性更強(qiáng)的鍵合相(長鏈與短鏈烷基鍵合相)；加兩性表面活件劑分離大分子和疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)等實(shí)驗(yàn)條件有利于蛋白質(zhì)樣品完全變性或盡可能降低變性。 色譜法的基本原理 利用樣品混合物中各組分理、化性質(zhì)的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當(dāng)兩相相對運(yùn)動時，各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配，結(jié)果使混合物得到分離。 兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。 分類： 根據(jù)流動相分—以氣體作流動相—?dú)庀嗌V——固定相為液體 氣-液色譜 固定相為固體 氣-固色譜 —以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜 固定相為固體 液-固色譜 —當(dāng)流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜 根據(jù)固定相的附著方式 —固定相裝在圓柱管中—柱色譜 —固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜） —液體固定相涂在紙上—紙色譜（平板色譜） 根據(jù)分離機(jī)理 —分配色譜—樣品組分的分配系數(shù)不同 —吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同 —體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開 —離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同 根據(jù)極性 —流動相極性＞固定相極性-反相色譜 —流動相極性＜固定相極性-正相色譜 氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。所以，HPLC的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過氣相色譜。 一、吸附色譜（adsorption chromatography） 又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。 分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質(zhì)表面有吸附ZX。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留時間不同和實(shí)現(xiàn)分離。 固定相： 固定相通常是強(qiáng)極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑?；钚怨枘zZ常用。 流動相： 弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。 應(yīng)用： 對于極性，結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是Z有效的方法，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生不對稱峰和拖尾現(xiàn)象。 二、分配色譜 原理： 固定液機(jī)械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據(jù)他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進(jìn)入兩相分配而實(shí)現(xiàn)分離。 固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。 根據(jù)極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上涂布的是極性固定液； 流動相是非極性溶劑； 可分立極性較強(qiáng)的水溶性樣品； 弱極性組分先洗脫出來。 反相分配色譜—固定相載體上涂布的是非極性或弱極性固定液； 流動相是極性溶劑； 強(qiáng)極性組分先洗脫出來。 液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差，且不能進(jìn)行梯度洗脫，已經(jīng)不大為人們所采用。 三、鍵合相色譜 考慮分配色譜法中固定液的缺點(diǎn)，因此將各種不同的有機(jī)關(guān)能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。 鍵合固定相優(yōu)點(diǎn)：○ 對極性有機(jī)溶劑有良好的化學(xué)穩(wěn)定性 ○使色譜柱的柱效高、壽命長 ○實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好 ○幾乎適于各種類相的有機(jī)化合物的分離，尤其是k’寬范圍的樣品 ○可以梯度洗脫 根據(jù)極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性 固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。 適于分離脂榮、水溶性的極性、強(qiáng)極性化合物 反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性 固定相：烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如Z常用的ODS柱或C18柱就 是Z典型的代表，其極性很小。 適于分離非機(jī)性、弱極性離子型樣品， 是當(dāng)今液相色譜的Z主要分離模式。 正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。 反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。 四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy） （又稱凝膠色譜和分子篩色譜） 原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目 的。大分子不進(jìn)入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強(qiáng)滯留，后被洗脫。 根據(jù)樣品性質(zhì)分類：凝膠過濾（GFC）—用于分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。 凝膠滲透（GPC）—用于分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。 SEC主要依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關(guān)。因此不采用改變流動相的組成來改善分離度。 五、離子交換色譜 （ion exchange chromatography， IEC） 分離原理：使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離；帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。

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