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  走巴走巴 2017-07-20 00:00:00

  菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同 蔗糖酶的提取及初提純?cè)囼?yàn)中影響酶得率得因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度、YZ劑、激活劑等。 實(shí)驗(yàn)原理： 蔗糖酶分離提純?cè)恚?酵母中的蔗糖酶含量很豐富，實(shí)驗(yàn)以安琪酵母粉為原料，首先采用自溶法破碎細(xì)胞壁、再用乙醇分級(jí)和DEAE—纖維素柱層析兩步分離提純，制備純度較高的蔗糖酶制劑。酶分離提純的原理與蛋白質(zhì)的相同。但酶是有催化活性的蛋白質(zhì)，在分離提純過程中必須注意：防止酶變性失活；隨時(shí)測(cè)定酶的比活力，并跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度及得率。 有機(jī)溶劑分級(jí)純化蔗糖酶原理： 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑—乙醇中溶解度的差異將蔗糖酶蛋白與其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)進(jìn)行有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀，而使提取的蔗糖酶得以純化（32％的乙醇飽和度沉淀分離雜蛋白，47.5％的乙醇飽和度沉淀分離酶蛋白）。操作必須在低溫下進(jìn)行且避免有機(jī)溶劑局部過濃；分離后應(yīng)立刻除去有機(jī)溶劑并用水或緩沖溶液溶解沉淀的酶蛋白（復(fù)溶），確保酶的活性；pH多選在酶蛋白的等電點(diǎn)附近；有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度減少變性，提高分離效果。 蔗糖酶的離子交換層析法純化原理： 本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-纖維素（DEAE-C11）微粒狀的、弱堿性的陰離子纖維素為柱料，進(jìn)行蔗糖酶的進(jìn)一步純化。它具有分辨率高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、有開放性的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)、有較大的表面積、對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量大等優(yōu)點(diǎn)；纖維素上離子基團(tuán)的數(shù)量不多，排列疏散，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離的目的，不致引起蛋白質(zhì)的變性。 蔗糖酶活力與比活的測(cè)定：在蔗糖酶的純化過程中，通過3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定蔗糖酶催化蔗糖生成還原糖的量，測(cè)定酶活力大小，跟蹤酶的活力。在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3min釋放lmg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位；通過Folin法測(cè)定酶蛋白的含量，計(jì)算蔗糖酶的比活。單位質(zhì)量的酶蛋白中所含酶的活力稱為酶的比活。 主要實(shí)驗(yàn)器材： 1. 試管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰鹽浴； 4. 恒溫水??； 5.離心機(jī)；6. 721- 型分光光度計(jì)；7. 柱層析裝置； 8. 梯度洗脫裝置；9. 部分收集器；10. 電磁攪拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纖維素。

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