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  龐小芹 2017-11-03 00:00:00

  你是做膠回收吧? 低溫會(huì)影響膠的溶解，室溫加快DNA溶解于溶液， 而且吸附柱在低溫下結(jié)合DNA的效率也低， Z后乙醇揮發(fā)也是在室溫的效果更好

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  heitiansh1 2017-11-03 00:00:00

  ①切膠回收dna片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。 ②主要還是DNA的濃度， 如果DNA濃度不夠， 想膠小點(diǎn)也不可能。 ③紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。 ④利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個(gè)原因：膠塊未完 全溶解，可適當(dāng)延長水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解;膠塊體積太大，應(yīng)先將其切為小塊，分多次回收;電泳緩沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合 DNA，如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整;漂洗液中未加入無水乙醇。 ⑤可以改用去離子水洗脫。但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當(dāng)調(diào)高其pH 值，以增加洗脫得率。 ⑥洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會(huì)影響后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收 效率低的解決方案。 ⑦不可以使用更小洗脫體積(小于說明書提供的Z小洗脫體積)進(jìn)行洗脫以提高濃度，因?yàn)檎f明書 提供的Z少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的Z小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。 ⑧電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。 ⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好;含目的片段的凝膠再空氣中放置過久， 使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存在4℃或-20℃;制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。 關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng) 1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片Z好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。 2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。 3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。 4. 按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已 知，根據(jù)尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。

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