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  王晉男4208 2012-07-31 00:00:00

  植物組織培養(yǎng)一般的的流程

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  曾經(jīng)曲折 2016-12-01 00:00:00

  植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本步驟 一、母液的配置 1、MS大量元素母液的配制 一般將大量元素配制成10倍的母液，使用時再稀釋10倍。按照配方表中用量依次分別稱取擴(kuò)大10倍的：NH4NO3 、KNO3 ，KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O的量，所有藥品稱取完畢后用蒸餾水逐個溶解，待全部溶解后，Z后定容至1000ml，轉(zhuǎn)入1000ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2、MS微量元素母液的配制 一般將微量元素配制成100倍的母液，使用時再稀釋100倍。按照配方表中用量分別依次稱?。篗nSO4 •4H2O、ZnSO4•7H2O 、H2BO3 、NaMoO4•2H2O、 CuSO4•5H2O、 CoCl2•6H2O擴(kuò)大100倍的量，用蒸餾水逐個溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至1000ml，轉(zhuǎn)入1000ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?3、MS鐵鹽母液配制 一般將鐵鹽配制成100倍的母液，使用時再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O的量，把FeSO4•7H2O和 Na2•EDTA•2H2O分別置于200ml蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解（磁力攪拌器，邊加熱，邊攪拌）。保持加熱，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不斷攪拌，接近沸騰時停止加熱，待溶液冷卻后加蒸餾水到Z終容積1000ml，置于棕色細(xì)口瓶中，用力振蕩1～2min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名。在室溫下避光保存一段時間令其充分反應(yīng)后，再置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?4、MS有機(jī)化合物母液的配制 一般將有機(jī)化合物配制成100倍的母液，使用時再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：肌醇、維生素B1、煙酸、甘氨酸、維生素B6的量，用蒸餾水依次溶解并定容至500ml后，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?二、植物激素的配置 常見激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激動素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6－芐氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、 1、生長素類： （1）、生長素類在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織 （2）、常見生長素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4－D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時間不要太久。 （3）、溶解方法：用少量1mol/L NaOH或95％酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容，以前者為好。 （4）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 2、細(xì)胞分裂素 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。 （1）、常用的細(xì)胞分裂素有： 6－芐氨基嘌呤（6－BA）、激動素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ） （2）、溶解方法：用少量（1ml）1mol/L HCL預(yù)溶解，再加蒸餾水定容。 （3）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 3、赤霉素（GA3） （1）、溶解方法：用少量95％酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容。 （2）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 （3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解 （4）、滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌 4、脫落酸 （1）、溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 （2）、保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 三、培養(yǎng)基的制備與滅菌 （一）、培養(yǎng)基的制備 1、將所需的各種母液和植物激素按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿等放在指定位置。 2、取燒杯一個內(nèi)盛200ml蒸餾水，按照培養(yǎng)基配方所需量依次取母液和植物激素加入燒杯，攪拌，按相應(yīng)培養(yǎng)基稱量蔗糖和瓊脂，并添加到燒杯中，在電爐上加熱待瓊脂完全融化后加蒸餾水定容至所需體積。 3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為培養(yǎng)基要求pH值。 4、趁熱把培養(yǎng)基分裝到廣口瓶中。封好瓶口。待滅菌。 （二）、培養(yǎng)基的滅菌 滅菌溫度及滅菌時間：121℃（1.06kg/cm2）下滅菌20分鐘。（如是實(shí)驗(yàn)所用菌材滅菌，如無菌水及器械，則是121℃（1.06kg/cm2）下滅菌30分鐘） 1、檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過少時應(yīng)加水。把分裝好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。 2、蓋上鍋蓋，注意按照說明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫度和時間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。 3、滅菌時間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到0時，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。 4、剛滅過菌的培養(yǎng)基成液體狀，取出時不要用力搖動，否則會導(dǎo)致部分培養(yǎng)基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷卻。在室溫下放置1-2天，觀察有無微生物生長，以確定培養(yǎng)基是否徹底滅菌。經(jīng)檢查沒有雜菌生長的方可使用。 四、無菌操作技術(shù)和接種 1、接種前，用75%酒精棉球擦拭超凈工作臺臺面，將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺臺面，打開超凈工作臺紫外燈及接種房間紫外燈，照射約30min，然后關(guān)閉紫外燈。打開房間換氣扇及微開超凈工作臺的玻璃擋板，通風(fēng)20min后，即可進(jìn)行無菌操作。（此步由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé)） 2、接種室滅菌過程中同時對外植體進(jìn)行表面滅菌。先將接種材料在流動的自來水下涮洗干凈，吸干水份后切成大約70mm長的片段放進(jìn)500ml燒杯中，用蒸餾水沖洗2次，倒掉蒸餾水后倒入0.1%的水消毒，將材料淹沒浸泡約10分鐘（期間用鑷子攪拌幾次）。 3、把在消毒液中的接種材料轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上。用無菌鑷子將已完成滅菌的接種材料轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無菌水清洗3次，每次不少于1分鐘，洗時不斷搖動燒杯以確保完全除去消毒液。 Z后一次清洗后轉(zhuǎn)移到無菌托碟上，將接種材料切成一定大?。ɑㄍ?.5cm2、莖段0.5-1cm）。 4、取下培養(yǎng)瓶的蓋子用火燒灼瓶口。用鑷子將外植體輕輕插入到瓊脂上，立即蓋上蓋子。 5、操作完后將鑷子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是將浸于酒精中的器械取出后置于酒精燈火焰上充分灼燒，待冷卻后方可使用。 6、將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱里，在要求溫度下培養(yǎng)，觀察記錄。

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