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  George926798 2011-12-09 00:00:00

  將正?；?qū)朐煅杉?xì)胞或其他組織細(xì)胞，以糾正其特定的遺傳性缺陷，從而達(dá)到ZL目的的方法。

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  幻雪夜57 2011-12-09 00:00:00

  基因ZL是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到ZL目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能ZL某種疾病。從廣義說，基因ZL還可包括從DNA水平采取的ZL某些疾病的措施和新技術(shù)。 基因ZL方法 1．基因轉(zhuǎn)移方法 　?。?）特異正常基因的分離與克?。簯?yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)結(jié)合基因定位研究成果，已有不少基因并將會有更多人類基因被分離和克隆，這是基因ZL的前提，在當(dāng)代分子生物技術(shù)條件下，一般來說，只要有基因探針和準(zhǔn)確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現(xiàn)在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因ZL前，分離克隆特異基因的有利條件。 　（2）外源基因的轉(zhuǎn)移：基因轉(zhuǎn)移是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)移方法較多，常用的要有下列幾類： 　　1）化學(xué)法：將正?；駾NA（及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到ZL目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。當(dāng)然，可以通過選擇培養(yǎng)的方法來提高轉(zhuǎn)化率。 　　2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。 　　①電穿孔法：電穿孔法是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時(shí)也會使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。 　 　②顯微注射法：顯微注射是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí)，有效率可達(dá)10%。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動(dòng)物就稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠，它可作為繁殖大量后代的疾病動(dòng)物模型。 　?、壑|(zhì)體法：脂質(zhì)體法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。 　　3）同源重組法：同源重組是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長，從而使未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。對于體細(xì)胞基因ZL，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間不能過長，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。今后如能改進(jìn)技術(shù)，提高重組率，這種定點(diǎn)修正基因的方法仍是有前景的。 　4）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體，將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。 　?、俜崔D(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點(diǎn)首先是具有穿透細(xì)胞的能力，可使近的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；其次，它能感染廣譜動(dòng)物物種和細(xì)胞類型而無嚴(yán)格的組織特異性；再者隨機(jī)整俁的病毒可長期存留，一般無害于細(xì)胞，但也存在缺點(diǎn)：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。Z嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險(xiǎn)性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點(diǎn)。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒。這樣的病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，有助于該DNA順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機(jī)的，所以還是可能激活細(xì)胞的原癌基因，以及因隨機(jī)插入發(fā)生插入突變。在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，Z常用于人類的是莫洛尼鼠白血病病毒，其人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)。 　?、贒NA病毒介導(dǎo)載體：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒。牛乳頭瘤病毒重組后，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨(dú)立復(fù)制，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。有人發(fā)現(xiàn)，因缺少E1區(qū)而致復(fù)制缺陷的腺病毒，可在表達(dá)E1基因的細(xì)胞中繁殖。后來證明，載有外源DNA的復(fù)制缺陷腺病毒呈現(xiàn)相同繁殖的特點(diǎn)。1993年美法等國成功采用腺病毒載體進(jìn)行心、腦、肺、肝內(nèi)膽管和肌肉組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。它代表了基因ZL的新方向。美國設(shè)計(jì)了一個(gè)新的腺病癥載體，它是用一個(gè)化學(xué)連接器即賴氨酸鏈將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運(yùn)輸器，通過一個(gè)表面抗體而進(jìn)入細(xì)胞核，使宿主基因與ZL基因共同表達(dá)。這個(gè)新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體。采用復(fù)制缺陷的腺病毒進(jìn)行基因ZL有以下優(yōu)點(diǎn)： 　?、僭摬《究筛腥痉至押头欠至训募?xì)胞，并能得到大量基因產(chǎn)物，對神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等基因缺陷的糾正有特殊意義； 　　②病毒顆粒相對穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低； 　?、劭捎行мD(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞后而少游離于細(xì)胞基因組外，并持續(xù)表達(dá)； 　?、芤延糜诨騔L的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。前述的新腺病毒載體還有一大優(yōu)點(diǎn)是可以成功地運(yùn)載48000bp的基因，而其它病毒只能運(yùn)輸70 00bp的基因。這些優(yōu)點(diǎn)顯示了腺病毒介導(dǎo)載體的廣闊應(yīng)用前景。 2．選擇靶細(xì)胞的原則 　　這里所指的靶細(xì)胞是指接受轉(zhuǎn)移基因的體細(xì)胞。 　　選擇靶細(xì)胞的原則是： 　?、俦仨気^堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)； 　?、诰哂性鲋硟?yōu)勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，Z后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期； 　?、垡子谑芡庠催z傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化； 　　④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)Z好具有組織特異性的細(xì)胞。目前使用得較多的是干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。許多遺傳病與造血細(xì)胞有關(guān)，故可用于如β地貧、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等的基因ZL。皮膚成纖維細(xì)胞易于移植和從體內(nèi)分離，又可在培養(yǎng)中生長，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因ZL。有不少遺傳病表現(xiàn)了肝細(xì)胞功能缺陷，因此，在家族性高膽固醇血癥的ZL中，有將低密度脂蛋白（LDL）受體基因轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞的嘗試。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌營養(yǎng)不良蛋白（minidystrophin）基因都已證明能在肌細(xì)胞中表達(dá)。 編輯本段基本程序 　　 基因ZL (一)ZL性基因的獲得 　　(二)基因載體的選擇 　　(三)靶細(xì)胞的選擇 　　(四)基因轉(zhuǎn)移方法 　　(五)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定 　　(六)回輸體內(nèi) 編輯本段基本步驟 目的基因的轉(zhuǎn)移 　　 基因ZL 在基因ZL中迄今所應(yīng)用的目的基因轉(zhuǎn)移方法可分為兩大類：病毒方法和非病毒方法。基因轉(zhuǎn)移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用為基因轉(zhuǎn)移的載體。常用的有反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體。轉(zhuǎn)移的基本過程是將目的基因重組到病毒基因組中，然后把重組病毒感染宿主細(xì)胞，以使目的基因能整合到宿主基因組內(nèi)。非病毒方法有磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等。

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