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  000誠心 2011-07-01 00:00:00

  樓上的回答很專業(yè)！！厲害

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  逸動(dòng)510 2016-12-02 02:30:49

  diyi法大腸桿菌MPN 計(jì)數(shù) 操作步驟 6.1、 樣品的稀釋 6.1.1、 固體和半固體樣品：以無菌操作取259 樣品，置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r / min ～1000r/ min 均質(zhì)1 min～2 min ，制成l:10 樣品勻液，或置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min 制成1:10 的樣品勻液。 6.1.2、 液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25 mL 置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10 的樣品勻液。 6.1.3、 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.5～7.5 之間，必要時(shí)分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L 鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。 6.1.4、 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管或吸頭反復(fù)吹打，使其棍合均勻，制成1:100 的樣品勻液。 6.1.5、 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10 倍遞增系列樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。 6.2、 初發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)樣品，選擇3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液）。每個(gè)稀釋度接種3 管月桂基磺酸鹽胰蛋白陳（LST ）肉湯，每管接種1 mL（如接種量超過1 mL ，則用雙料LST 肉湯）。36℃±1℃ 培養(yǎng)24h±2h ，觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h 。記錄在24h～48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。如所有LST 肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸桿菌MPN 結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。 6.3、 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 用接種環(huán)分別從所有培養(yǎng)48h±2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中取培養(yǎng)物1 環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45 ℃ 的EC 肉湯管中，放人帶蓋的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h±2h ，檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h ±2h 。記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的EC 肉湯管數(shù)。如所有EC 肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸桿菌MPN 結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB 平板分離培養(yǎng)。 6.4、 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng) 輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線分別接種于EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18h～24h 。檢驗(yàn)平板上有無具黑色ZX有光澤或無光澤的典型菌落。 6.5、 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng) 從每個(gè)平板上挑5 個(gè)典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落ZX部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培養(yǎng)18h～24h 。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。 6.6 、生化試驗(yàn) 6.6.1、 靛基質(zhì)試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種蛋白陳水，36 ℃±1℃ 培養(yǎng)24h±2h 后，加Kovacs 靛基質(zhì)試劑0.2 mL～0.3 mL ，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。 6.6.2 、MR -VP 試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種MR -VP 培養(yǎng)基，36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)48h±2h 。移取培養(yǎng)物1mL至13 mm×100mm 試管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氫氧化鉀溶液0.2mL 和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h ，如出現(xiàn)伊紅色，為VP 試驗(yàn)陽性。 將MR 一VP 培養(yǎng)液的剩余部分再培養(yǎng)48h 后滴加5 滴甲基紅指示劑。培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。 6.6.3、 檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種Koser 氏檸檬酸鹽肉湯，36℃±1 ℃ 培養(yǎng)96h±2h，記錄有無細(xì)菌生長。 6.7、 大腸桿菌MPN 計(jì)數(shù)的報(bào)告 大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC 生化試驗(yàn)為＋＋- -或-＋- -。只要有1 個(gè)菌落鑒定為大腸桿菌，其所代表的LST 肉湯管即為大腸桿菌陽性。依據(jù)LST 肉湯陽性管數(shù)查MPN 表，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌MPN 值。 第二法大腸桿菌VRB - - MUG 平板計(jì)數(shù)法 8、樣品稀釋 按6.1 進(jìn)行。 9、 檢驗(yàn) 選取2 個(gè)～3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別取1 mL 注人兩個(gè)無菌平皿。另取1 mL 稀釋液注人一個(gè)無菌平皿中，作空白對(duì)照。將45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 瓊脂10 mL～15 mL 傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 瓊脂覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng)18h～24h 。選擇菌落數(shù)為10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波長紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。 檢驗(yàn)時(shí)用已知MUG 陽性菌株（如大腸桿菌ATCC 25922 ）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC 13048 ）做陽性和陰性對(duì)照。 10、 大腸桿菌平板計(jì)數(shù)的報(bào)告 兩個(gè)平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。 第三法大腸桿菌PetrifilmTM 測試片計(jì)數(shù)法 12、 樣品稀釋按6.1 進(jìn)行。 13、 檢驗(yàn) 13.1、 接種和培養(yǎng) 選取2 個(gè)～3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種兩張測試片。將測試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，。揭開上層膜，用吸管吸取樣品勻液1ml勻液垂直滴加在測試片的ZY，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下，將壓板（平面底朝下）放置在上層膜ZY處，輕輕地壓下，使樣品勻液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜表面，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養(yǎng)基凝固。將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過20 片，36℃±1 ℃ 培養(yǎng)。肉、家禽和水產(chǎn)品，培養(yǎng)時(shí)間為24h±2h；其他食品，培養(yǎng)時(shí)間為48h±2h 。 13.2、 判讀 可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。藍(lán)色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸桿菌，不論藍(lán)色的深淺，部分藍(lán)色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。圓形培養(yǎng)膜邊緣及邊緣以外的菌落不計(jì)數(shù)。當(dāng)測試片出現(xiàn)大量氣泡、不明顯的小菌落，培養(yǎng)區(qū)呈藍(lán)色時(shí)，需要進(jìn)一步稀釋樣品勻液，重新檢驗(yàn)。 14 大腸桿菌測試片計(jì)數(shù)的報(bào)告 選擇菌落數(shù)在15～150 之間的稀釋度，兩張測試片菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。 如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15 ，計(jì)數(shù)Z低稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，以“小于1 乘以Z低稀釋倍數(shù)”報(bào)告；如果所有稀釋度的菌落數(shù)都大于150 ，計(jì)數(shù)Z高稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150 個(gè)的測試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20 ，即為測試片上估算的菌落數(shù)（圓形生長面積為20 cm " ）。 這里可以下載此標(biāo)準(zhǔn)http://www.51zbz.com/biaozhun/134141.html

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