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  楓度翩翩007 2017-09-23 00:00:00

  激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代Z先進的細胞生物醫(yī)學分析儀器之一。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動態(tài)變化過程等研究，并提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領(lǐng)域得到廣泛應用。 1. 組織和細胞中的定量熒光測定 激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦熒光進行數(shù)據(jù)采集和定量分析，同時還可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加， 形成組織或細胞中熒光標記結(jié)構(gòu)的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、單個活細胞水平的 DNA 損傷及修復等定量分析。 2. 細胞間通訊的研究 動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測量傳遞細胞調(diào)控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。 該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學物質(zhì)。 3. 細胞物理化學測定 激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長、面積、平均熒光強度及細胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進行自動測定。 能對細胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。 4. 細胞內(nèi)鈣離子和 pH 值動態(tài)分析 激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個細胞內(nèi) pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細胞內(nèi)的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測細胞內(nèi)離子量變化的速度相對較快，但其圖像本身的價值較低，而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像，這對于研究鈣等離子細胞內(nèi)動力學有意義。 4. 三維圖像的重建 傳統(tǒng)的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實時掃描成像，進行圖像疊加可構(gòu)成樣品的三維結(jié)構(gòu)圖像。 它的優(yōu)點是可以對樣品的立體結(jié)構(gòu)分析，能十分靈活、直觀地進行形態(tài)學觀察，并揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。 5. 熒光漂白恢復技術(shù) 該方法的原理是一個細胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力，而鄰近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可逐漸恢復。 可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。 6. 長時程觀察細胞遷移和生長 活細胞觀察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養(yǎng)液的適宜溫度及 CO2 濃度的恒定。 目前的激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產(chǎn)生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結(jié)合后可以減小每次掃描時激光束對細胞的損傷，用于數(shù)小時的長時程定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現(xiàn)象。 7. 在細胞及分子生物學基礎研究中的應用 激光掃描共聚焦顯微鏡應用照明針與檢測孔共軛成像，有效YZ了焦外模糊成像并可對標本各層分別成像，對活細胞行無損傷的“光學切片”這種功能也被形象的稱為“顯微 CT”。CLSM 還可以對貼壁的單個細胞或細胞群的胞內(nèi)、胞外熒光作定位、定性、定量及實時分析，并對胞內(nèi)成分如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+ 等的分布、含量等進行測定及動態(tài)觀察，使細胞結(jié)構(gòu)和功能方面的研究達到分子水平。 8. 在腫瘤和藥物篩選研究中的應用 普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關(guān)抗原進行定性分析，而 CLSM 則可對單標記或者多標記細胞、組織標本及活細胞進行重復性的熒光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結(jié)構(gòu)特征，抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化。 9. 在血液病學和醫(yī)學免疫學研究中的應用 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察免疫細胞和系統(tǒng)，如樹突狀細胞、單核-吞噬細胞系統(tǒng)、自然殺傷細胞、淋巴細胞時，在準確細胞定位的同時有效鑒定免疫細胞的性質(zhì)。 10. 在大腦和神經(jīng)科學中的應用 激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突的內(nèi)部結(jié)構(gòu)連續(xù)性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察到腦干組織中神經(jīng)軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象。并且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀察神經(jīng)軸突的三維結(jié)構(gòu)，因此應用 CLSM 有可能觀察到普通光鏡下未能發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)組織的細微病變。 11. 在眼科研究中的應用 利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察晶狀體，角膜、視網(wǎng)膜、虹膜和睫狀體的結(jié)構(gòu)和病理變化。 12. 在骨科研究領(lǐng)域中的應用 激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領(lǐng)域的應用現(xiàn)狀表明，CLSM在觀測骨細胞形態(tài)學研究、骨細胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用具有顯著的優(yōu)勢。

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