實時熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團（探針或染料），利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過Cq或Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進行絕對定量或相對定量分析。而評估熒光定量PCR反應(yīng)效果好壞，可以從以下幾個方面來評估：

1.擴增效率及相關(guān)系數(shù)

良好的PCR擴增是指數(shù)級的，理論上以100%的效率進行，但實際上并不是所有的PCR反應(yīng)都表現(xiàn)出相同的高效率，所以需要驗證實際的擴增效率E。當(dāng)計算評估PCR擴增效率時，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度，得到線性方程Cq= -klgX0+b、擴增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之間，即擴增效率在90-110%，被認(rèn)為此擴增接近理想情況；相關(guān)系數(shù)R2值大于0.98時，說明兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好，可用來計算。

▲ 圖1. 5個梯度稀釋液的擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖源：Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統(tǒng)

2.精確度（Precision）

指多個復(fù)孔Cq值之間的接近程度，且重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說明實驗的重復(fù)性較好。

▲ 圖2. 96孔重復(fù)的擴增曲線，Cq Mean=19.1，CV=0.002

圖源：Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統(tǒng)

3. 重現(xiàn)性（Reproducibility）

指不同批次之間或不同實驗室之間的結(jié)果變化，通常通過SD或者CV來評估。

▲ 圖3. 4臺獨立的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統(tǒng)同時檢測GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002

4. 靈敏度（Sensitivity）

通常靈敏度表示為檢測限(limit of detection, LOD)，可通過梯度稀釋樣品來確定最低檢測限。分析靈敏度是指一個樣本可通過實驗精確測量的最小拷貝數(shù)。

5. 準(zhǔn)確度（Accuracy）

指測量值與真實值的接近程度。針對低拷貝樣本，由于受采樣概率的影響，可能會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。為了更可靠地檢測低拷貝，可以增大平行實驗的重復(fù)數(shù)，來統(tǒng)計顯著性。

▲ 圖4. 低拷貝樣本采樣概率符合泊松分布

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6. 特異性（Specificity）

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列?？赏ㄟ^凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來判斷。

▲ 圖5. 溶解曲線單峰

圖源：Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統(tǒng)

通過這六個方面就可以評估實時熒光定量PCR反應(yīng)效果。你學(xué)會了嗎？實驗數(shù)據(jù)是好是壞快來自檢吧。

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