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  妮倪2 2016-12-17 00:00:00

  不同細菌感受態(tài)制備方式相同 方法一： 細菌轉化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發(fā)現(xiàn)為基礎，其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化。 用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。操作過程簡述如下。 1．從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量OD600值≈0.4。 2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。 3．于4℃用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。 4．倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使Z后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 5．以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。 6．于4℃用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。 7．倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使Z后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 8．每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩? 9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。 10．將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。 11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。 12．每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。 13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/l MgSO4和相應抗生素的SOB培養(yǎng)基上。 14．將平板置于室溫至液體被吸收。 15．倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。 方法二： CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，便于質(zhì)粒DNA的轉化，可滿足一般實驗的要求。與CaCl2法相比具有多種優(yōu)點：使用方便，只需一步即可完成感受態(tài)細胞的制備；轉化效率略高于CaCl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態(tài)細胞制成后即可保存于-70℃，無須加入甘油，并且經(jīng)長期保存活力無明顯下降。 準備工作： 1． 從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線，37度過夜至長 出單菌落。挑形態(tài)飽滿的單菌落2個，分別接種5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm， 過夜培養(yǎng)。 2． 次日從5ml LB培養(yǎng)物吸取200μl轉入50ml LB培養(yǎng)基中（250ml 錐形瓶），37 ℃，250rpm培養(yǎng)2小時，此時OD600約0.4—0.5。 感受態(tài)細胞的制備： 3． 吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。 4． 加入100μl預冷的Solution A，懸浮菌體，冰浴30分鐘。 5． 此時感受態(tài)細胞已經(jīng)制成可立即使用或-70℃保存。 細胞轉化： 6． 在感受態(tài)細胞中加入100pg-10ngDNA，混勻，冰浴30分鐘，然后42℃ 1分鐘熱 擊，再次冰浴2 分鐘。加入0.9ml LB 培養(yǎng)基，20μl Solution B，37℃，振蕩 培養(yǎng)1小時。 7． 取適當菌液（100-200μl）涂布相應抗性的平板。 8． 過夜培養(yǎng)約16個小時，數(shù)菌落數(shù)，計算轉化率。 補充說明： 1． 所用器具一定要清潔； 2． 操作步驟2 中培養(yǎng)基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml 錐形 瓶裝100ml培養(yǎng)基，250ml錐形瓶裝50ml培養(yǎng)基； 3． 在收獲菌體前半小時還可以在培養(yǎng)基中加入20mM的MgCl2 ，效果會更好一些； 4． 為保證細胞處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)后的菌體的OD值不要高于0.6； 5． 制備感受態(tài)細胞時所有操作盡量保證在冰上操作； 6． 細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB，簡化操作 步驟，但轉化效率低于熱擊方法，適用于對轉化率要求不高的實驗。 方法三： 1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜 2、取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3 ml離心管中，冰浴10min。 4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液 5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液 7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。 方法四： （1）將1ml過夜培養(yǎng)的細菌（如DH52、TG1、TM101）接種于100ml2×YT培養(yǎng)于500ml 燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通常≥200rpm培養(yǎng)的細菌密度約OD550=0.2～0.5(5×107 cells/ml)，需2～4h。 （2）將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min，于4℃離心細菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。 （3）棄除上清，將細菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris·HCl（pH8.0）無菌冷凍液體中。 （4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。 （5）棄上清，懸浮細菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態(tài)細胞，即可用于轉化。200μl分裝于無菌的1.5ml微量離心管中，貯存于-80℃冰箱中。 方法五： TSB法（也是本人熱衷的方法） 1.藥品制備 1M Mg2+ (1M MgSO4 和 1M MgCl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾CJ。 TSB液（30mL/ 80mL菌液）（現(xiàn)配現(xiàn)用）： PEG3350 3g Tryptone 0.3g Yeast extract 0.15g NaCl 0.3g 2. 步驟： （1）活化菌株 （2）挑單菌落培養(yǎng)于5mL 的液笨培養(yǎng)基中 （3）取液體培養(yǎng)物50uL于80mL的液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng) （4）370 C培養(yǎng)3－4小時，OD600在0.4－0.6 （5）離心，去上清 （6）加入20mLTSB，重懸 （7）離心，去上清 （8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分裝保存 注，整個操作過程均應在冰上進行。所用藥品均需滅菌。 轉化程序 （1）取出200μl感受態(tài)細胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或連接反應混合物，DNA量通?！?0mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然后放在冰上40～45min。 （2）將管放于42℃水浴中2min。 （3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基，倒置混勻，并于37℃培養(yǎng)8～12h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細菌生長并開始表達KJ素。 （4）每200μl轉化混合物分別于6個2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補充相應抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。

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