ELISA實(shí)驗(yàn)原理：ELISA的原理、類型及操作步驟

　　ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

　　ELISA方法類型和操作步驟

　　elisa可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

　　(一)雙抗體夾心法

　　雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

　　(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

　　(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

　　(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

　　根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。

　　(二)雙位點(diǎn)一步法

　　在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　　(三)間接法測(cè)抗體

　　間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

　　(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。

　　(3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接dibiao記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

　　(4)加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

　　本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。

　　(四)競(jìng)爭(zhēng)法

　　競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　　(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

　　(2)待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。

　　(3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

　　(五)捕獲法測(cè)IgM抗體

　　血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下：

　　(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

　　(2)加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

　　(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

　　(4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

　　(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應(yīng)。

　　(六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

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　　紐扣拉力測(cè)試儀可配置NK、HP系列推拉力計(jì)和專用夾具，專用于測(cè)量鈕扣的扣合力或脫離衣物破壞力。檢測(cè)鈕扣、按鈕等固定強(qiáng)度是很重要的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是在嬰兒和兒童服裝設(shè)計(jì)及制造中很重要。在鈕扣固定裝飾件上使用一定力的測(cè)量需要通過(guò)力度儀器來(lái)記錄。

　　符合標(biāo)準(zhǔn)：

　　CFR1500.51-53，ASTMPS79-96，GB6675，ISO8124

　　技術(shù)特點(diǎn)：

　　1.由凹面無(wú)爪鉗、底部織物鉗及Imada推拉力表組成。

　　2.紐扣部件由凹面無(wú)爪鉗固定，衣物由底部織物鉗固定。

　　技術(shù)參數(shù)：

　　外形尺寸：280×220×770mm(L×W×H)

　　重量：23kg

　　測(cè)試原理：

　　通過(guò)旋轉(zhuǎn)上部調(diào)速輪，用戶可以施加固定的力，并記錄固定的力度或斷裂力度。采用夾鉗及附件，還可以測(cè)試其它紐扣、牛仔扣、四孔紐扣及衣物附件，如拉鏈、領(lǐng)結(jié)、貼花、吊鉤、D形環(huán)等。

　　操作步驟：

　　1.裝上夾具，配合測(cè)試的紐扣，將測(cè)試的樣板鎖緊于底座；

　　2.放下夾具，將紐扣抓緊并向上拉，每組紐扣需可承受17磅拉力即7.72kg及需保持10秒而沒(méi)有松脫或破損之痕跡，需同時(shí)測(cè)試每款20粒紐扣，方算合格；

　　3.如其中一粒紐扣松脫或破損，或更換后必需全部再驗(yàn)。

　　意義及作用：

　　1、 此儀器的測(cè)試方法用作量度對(duì)鈕扣及衣物進(jìn)行垂直拉力測(cè)試的力度，而鈕扣及按鈕并不拉扯至脫離衣物。

　　2、 此方法所要求鈕扣縫紉規(guī)格應(yīng)該按照鈕扣制造商所定的標(biāo)準(zhǔn)。

　　3、 此測(cè)試方法用于建立不同穿著環(huán)境的關(guān)連性，以及對(duì)不同鈕的各類和品牌作出比較。

　　4、 此標(biāo)準(zhǔn)可能包含危險(xiǎn)物料，操作及儀器，而標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)沒(méi)有列出所有可能在使用上出現(xiàn)的安全問(wèn)題。故此標(biāo)準(zhǔn)的使用者責(zé)任建立有關(guān)的安全和建康的規(guī)則，以及在使用前決定適當(dāng)?shù)囊?guī)條。

　　5、 所有鈕扣都需要用鎖鏈針步縫緊在布料上。

　　6、 按照測(cè)試要求，當(dāng)zui大的鈕扣尺寸是大于6mm或小于/等于6mm，鈕扣就改須能分別承受90N有50N的拉力。