一、熒光基礎(chǔ)知識(shí)

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長(zhǎng)的光線，然后再發(fā)射出其他波長(zhǎng)的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團(tuán)。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團(tuán)的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長(zhǎng)比激發(fā)光更長(zhǎng)。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)過(guò)程，在熒光顯微技術(shù)中具體體現(xiàn)為以下幾個(gè)關(guān)鍵部件：

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個(gè)指標(biāo)

? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團(tuán)在特定波段范圍才能被大部分激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團(tuán)激發(fā)特征。

? 發(fā)射光譜波段的強(qiáng)度：熒光信號(hào)一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)的發(fā)射熒光信號(hào)。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個(gè)

? 激發(fā)濾光片EX：濾過(guò)光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

? 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團(tuán)發(fā)射的特定波段的光通過(guò)

? 二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過(guò)發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒(méi)有這個(gè)濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會(huì)有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家品牌，不同波段需求的激發(fā)塊）

二、熒光顯微成像的應(yīng)用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學(xué)）、礦物、材料科學(xué)等領(lǐng)域的顯微熒光觀測(cè)。①在生物學(xué)領(lǐng)域，主要借助熒光染料標(biāo)記，可準(zhǔn)確和詳細(xì)地識(shí)別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分。②在礦物學(xué)領(lǐng)域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學(xué)，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來(lái)分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導(dǎo)體領(lǐng)域，也可用來(lái)觀測(cè)具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用是廣泛也是復(fù)雜的，主要是對(duì)細(xì)菌、細(xì)胞、組織或小型生物（如斑馬魚(yú)等模式生物）進(jìn)行標(biāo)記成像，它的微觀層面都是通過(guò)熒光染料對(duì)分子層面進(jìn)行標(biāo)記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個(gè)因素，一是熒光染料標(biāo)記的位置，二是該染料對(duì)應(yīng)的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對(duì)核酸、聚糖進(jìn)行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測(cè)。以下根據(jù)染料結(jié)合的位置列舉了一些常見(jiàn)的熒光染料及應(yīng)用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標(biāo)記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號(hào)，即通過(guò)克隆技術(shù)用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標(biāo)記的抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機(jī)熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團(tuán)結(jié)合，主要用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標(biāo)記顯影時(shí)背景弱，信號(hào)強(qiáng)。除細(xì)胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學(xué)顯影、小動(dòng)物體內(nèi)成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標(biāo)識(shí)涵蓋了對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標(biāo)記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對(duì)核酸進(jìn)行標(biāo)記與研究同樣有重要意義，如對(duì)細(xì)胞核（主要成分為核酸）進(jìn)行染色標(biāo)記可以判斷細(xì)胞的數(shù)量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，在358nm處有一個(gè)吸收峰值，在461nm處有一個(gè)發(fā)射峰值，其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可與RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果。DAPI可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜，因此被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍(lán)靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過(guò)完整細(xì)胞膜，被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過(guò)細(xì)胞膜的DNA染色劑。與核酸結(jié)合后，激發(fā)波長(zhǎng)為538 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為617 nm。由于該染色劑無(wú)法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開(kāi)文獻(xiàn)
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細(xì)胞中各種離子的流動(dòng)與分布對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的深入理解有重要作用。通過(guò)各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結(jié)合形成熒光團(tuán)，利用光譜特征檢測(cè)對(duì)應(yīng)離子的分布狀態(tài)。

三、熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應(yīng)用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行成像的過(guò)程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對(duì)比度、熒光信號(hào)強(qiáng)弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對(duì)樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應(yīng)用中的常見(jiàn)挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì)方法：

汞燈需搭配帶計(jì)時(shí)器的復(fù)雜控制箱來(lái)使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強(qiáng)，但使用有很多麻煩，首先需要預(yù)熱，然后光強(qiáng)靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，壽命較短可能就200小時(shí)，在壽命用完前還會(huì)有光強(qiáng)衰減問(wèn)題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應(yīng)用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長(zhǎng)單個(gè)可以頂50個(gè)汞燈，光強(qiáng)更穩(wěn)定可控，并且可以即開(kāi)即用，省事省心。

明美可定制適配四家品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會(huì)影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過(guò)率，影響熒光效率并帶來(lái)雜散光和背景噪聲問(wèn)題。同時(shí)，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會(huì)對(duì)熒光效果產(chǎn)生重大影響。對(duì)于簡(jiǎn)易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四家品牌顯微鏡升級(jí)熒光觀察，簡(jiǎn)單易用效果好。對(duì)于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四家品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對(duì)樣本的影響，如細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子在與氧反應(yīng)時(shí)吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細(xì)胞等生物樣本損傷的主要來(lái)源。通常的應(yīng)對(duì)思路是：①使用具有較低能量（波長(zhǎng)較長(zhǎng)）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強(qiáng)和盡可能短的激發(fā)時(shí)間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長(zhǎng)時(shí)間的熒光成像中，這種情況需要提高相機(jī)的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號(hào)。

（單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，尤其是在對(duì)活細(xì)胞標(biāo)記成像時(shí)，需同時(shí)對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并在一個(gè)圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標(biāo)記時(shí)會(huì)出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對(duì)于多色熒光成像，有兩種應(yīng)對(duì)思路，一是針對(duì)每種染料使用對(duì)應(yīng)的單通道窄帶濾光片，后通過(guò)軟件進(jìn)行合成，這種方式對(duì)成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時(shí)激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點(diǎn)是允許兩種或以上波段熒光信號(hào)通過(guò)，可實(shí)現(xiàn)一組濾光片同時(shí)觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒(méi)有重疊，所得到的熒光信號(hào)之間能較好的被區(qū)分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時(shí)觀察到B\G兩種熒光信號(hào)）

來(lái)源：https://www.mshot.com/article/1527.html